復方北冬蟲夏草提取工藝及其對鏈尿佐菌素誘導1型糖尿病大鼠的降血糖作用研究

徐 健,盧學春,段懿涵,王 珊,盛 瑜,徐廣宇,安麗萍,杜培革,孫晶波,*

(1.北華大學藥學院,吉林吉林 132013;2.解放軍總醫院南樓血液科,北京 100853)

糖尿病是一種常見的代謝紊亂性疾病[1],主要與遺傳、年齡、收入、社會地位和受教育程度等因素相關[2]。該病以慢性高血糖為主要特征,常伴有“三多一少”癥狀,長期處于病理狀態可引發腎、肝等多器官疾病,進而嚴重影響患者的生活質量。良好的血糖控制可降低與糖尿病相關慢性病的風險及并發癥[3]。因此,如何預防及治療糖尿病已成為重要的全球議題。鏈尿佐菌素(STZ)是由產色鏈霉菌產生的抗生素,常作為糖尿病模型誘導劑,選擇性破壞胰腺β細胞,使細胞活性降低,導致胰島素對組織攝取葡萄糖和高血糖的敏感性較差[4],還能夠影響肝細胞和腎小管細胞的表達,這也是STZ對肝臟和腎臟產生毒性的原因之一[5]。

北冬蟲夏草(Cordycepsmilitaris),別名蛹蟲草、北蟲草,隸屬于子囊菌亞門,麥角菌科,蟲草屬[6],性平,味甘,入肺腎二經,既補肺陰,又補腎陽,是長白山地區資源豐富且藥食同源的道地藥材,其主要活性成分有腺苷、多糖、蟲草酸、蟲草素以及氨基酸等[7]。其中的多糖類成分具有多種生物活性。Liu等[8]研究表明,北冬蟲夏草多糖具有激活免疫細胞、改善和修復受損胰島細胞的降糖功效,并能顯著改善糖尿病小鼠體重及其臟器指數。黃芪、枸杞、西洋參也有不同程度的降糖和提高免疫力的作用[9-11],但以北冬蟲夏草為主藥協同其他藥材發揮降糖效果鮮有研究。因此,本試驗即通過觀察復方北冬蟲夏草提取物對STZ誘導1型糖尿病大鼠的血糖相關指標以及氧化應激和脂代謝的影響,探究其降糖功效,為藥食同源類中藥品種在中藥降糖藥物或保健品的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北冬蟲夏草 鐵嶺市云欣蟲草生物有限公司開原分公司;黃芪、枸杞子、西洋參 威海松嶺諾可佳中藥飲片股份有限公司;Amberlite-XAD-2大孔樹脂 鄭州艾諾化工科技有限公司;葡萄糖、人參皂苷 中國藥品生物制品鑒定所;乙醇等化學試劑 均為分析純,沈陽華東試劑廠;Wistar雄性大鼠 長春市億斯實驗動物技術有限公司,許可證號碼:SCXK(吉)-2016-0003;鏈脲佐菌素 Sigma公司;甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、超氧化物歧化酶測試盒、丙二醛測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、胰島素測試盒 南京建成生物工程研究所。

DHG-9070A真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;UV2600紫外分光光度計 島津;R5005KB旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;TD-3213血糖儀 Roche Diagnostics Gmbh。

1.2 實驗方法

1.2.1 復方北冬蟲夏草提取物的制備 北冬蟲夏草22.5 g、黃芪40 g、枸杞30 g、西洋參25 g→雙餾水浸泡1.5 h→恒溫水浴回流提取→濾液→濃縮→真空干燥至恒重→復方北冬蟲夏草提取物。

操作要點:恒溫水浴回流提取后過濾,收集濾液,于70 ℃條件下濃縮至膏狀,于真空干燥箱中干燥至恒重,磨成粉末,計算提取率,密封備用。

提取率(%)=[干燥后所得粉末(g)/原料藥材總重量(g)]×100

1.2.2 標準曲線的繪制及總皂苷含量計算 總皂苷含量采用紫外分光光度法測定[12],以人參皂苷Re為標品(2.000 mg/mL),繪制標準曲線,以1.2.1中提取物配制樣品并測定其吸光度值,帶入標準曲得皂苷質量,計算總皂苷含量。

總皂苷得率(%)=(樣品容積÷測定取樣量×總皂苷含量÷樣品的總質量)×100

1.2.3 標準曲線的繪制及多糖含量計算 多糖含量采用“苯酚-硫酸分光光度測定法”測定[13],以葡萄糖為標品(0.100 mg/mL),繪制葡萄糖標準曲線,以1.2.1中提取物配制樣品并測定其吸光度值,帶入標準曲得多糖質量,計算多糖含量。

多糖得率(%)=[樣品容積÷測定取樣量×多糖含量÷樣品的總質量]×100

1.2.4 單因素實驗 根據前期預實驗,提取率能夠間接反映提取物中多糖的含量,且測定簡單,故選擇提取率作為單因素實驗檢測指標。

1.2.4.1 料液比對提取率的影響 按1.2.1中配比稱取樣品,固定反應條件為提取時間1 h,提取次數1次,提取溫度70 ℃,考察不同料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)對提取率的影響。

1.2.4.2 提取時間對提取率的影響 固定反應條件料液比1∶8 g/mL,提取次數3次,提取溫度70 ℃,考察不同提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對提取率的影響。

1.2.4.3 提取次數對提取率的影響 固定反應條件料液比1∶8 g/mL,提取時間1 h,提取溫度70 ℃,考察不同提取次數(1、2、3、4、5次)對提取率的影響。

1.2.4.4 提取溫度對提取率的影響 固定反應條件料液比1∶8 g/mL,提取時間1 h,提取次數1次,考察不同提取溫度(60、65、70、75、85 ℃)對提取率的影響。

1.2.5 正交試驗 根據預試驗及單因素實驗結果確定因素水平,詳見表1。以多糖含量和提取率為考察指標,采用L9(34)正交試驗優化提取工藝。

表1 正交試驗的因素水平設計

1.2.6 STZ誘導大鼠糖尿病模型的建立 將飼養一周后的大鼠分出10只作為空白組,腹腔注射生理鹽水。其余大鼠分別單次腹腔注射STZ溶液(STZ溶于0.1 mol·L-1、pH=4.3的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中)50 mg/kg,單次注射STZ前均斷糧不斷水12 h,7 d后檢測大鼠血糖值,以血糖值>15 mmol/mL為糖尿病模型建立成功標準。

1.2.7 動物給藥和分組 取成模大鼠40只隨機平均分為模型組(生理鹽水)、低(250 mg/kg)、中(500 mg/kg)、高(1000 mg/kg)劑量組。空白組直接給予生理鹽水。各組給藥采取灌胃方式,每日一次,期間給予充足的水及飼料。給藥12周后,用10%的水合氯醛麻醉,觀察并記錄各組實驗大鼠的體重。

1.2.8 血糖值及血清胰島素含量檢測 麻醉后,腹主動脈取血,靜置后4 ℃離心(3000 r/min)10 min,取血清,按照試劑盒說明書測定大鼠空腹血糖值和胰島素含量。

1.2.9 大鼠肝組織中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力和腎臟甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)含量檢測 解剖實驗大鼠,取肝臟和腎臟,嚴格按照試劑盒標準檢測肝臟中MDA含量、SOD、GSH-PX活力及腎臟中TG、TC含量。

1.2.10 腎臟組織形態學觀察 新鮮腎臟組織于福爾馬林中固定24 h,經程序脫水、石蠟包埋后,5 μm切片,用于組織HE染色檢測。

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 復方北冬蟲夏草提取物制備工藝優化

2.1.1 人參總皂苷Re標準曲線 在560 nm波長下測定吸光度值,以人參皂苷Re質量為橫坐標(mg),吸光度值為縱坐標,繪制人參總皂苷含量與吸光度的標準曲線(見圖1),計算回歸方程Y=3.035X+0.1062,R2=0.9976,線性關系良好。

圖1 人參皂苷Re標準曲線

2.1.2 葡萄糖標準曲線 在490 nm波長下測定吸光度值,以葡萄糖質量為橫坐標(mg),吸光度值為縱坐標,繪制葡萄糖含量與吸光度的標準曲線(見圖2),計算得回歸方程Y=4.0694X+0.0129,R2=0.99746,線性關系良好。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.1.3 單因素實驗 單因素實驗結果見圖3～圖6。結果表明,當料液比偏小時(圖3),固/液兩相間有效成分的濃度差較小,溶液黏性較大,不利于有效成分的溶出。隨著料液比的增大,兩相濃度差增大,提取率增高,當料液比達到1∶10 g/mL時,提取較為充分,而過大的料液比,不但造成了資源的浪費,對于提取效果也無明顯影響,因此選擇1∶8、1∶10、1∶12 g/mL三個因素進行正交試驗。如圖4所示,提取率隨著時間的延長而升高,超過1.5 h后,提取率不再明顯增加,考慮獲得較高得率和工業生產能耗,選擇1、1.5、2 h三個水平進行正交試驗。如圖5所示,當提取次數為2次時,提取率明顯提高,且隨時間的增加,變化率不再明顯,考慮工業生產和材料成本,選擇1、2、3次三個水平進行正交試驗。如圖6所示,隨著提取溫度的升高,提取率在75 ℃之后增加不再明顯,故選擇70、75、80 ℃三個水平進行正交試驗。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 提取時間對提取率的影響

圖5 提取次數對提取率的影響

圖6 提取溫度對提取率的影響

2.1.4 正交試驗結果及極差分析 對提取工藝進行優化,結合正交試驗結果及極差分析,由表2可知,各因素對復方北冬蟲夏草提取率的影響由大到小依次為提取次數>提取時間>料液比>提取溫度,最佳因素的水平組合為A3B2C3D2;各因素對于多糖提取的影響由大到小依次為料液比>提取溫度>提取時間>提取次數,最佳因素的水平組合為A1B2C3D1,各因素對于總皂苷提取的影響由大到小依次為提取次數>提取溫度>提取時間>料液比,最佳因素的水平組合為A2B2C2D2和A2B2C3D2,三者搭配間唯有BC一致,根據直觀分析和經濟效益以及單因素實驗結果等多方面考量,確定A2B2C3D1為最佳提取工藝參數,即料液比為1∶10 g/mL,提取3次,每次提取1.5 h,提取溫度為70 ℃。經三次平行試驗驗證平均提取率為53.1%,平均多糖得率為5.1 g/10 g,平均總皂苷得率為1.3 g/10 g,與正交試驗表中該組結果相近,證明該工藝重復性良好、穩定。

表2 正交試驗結果及極差分析

2.2 糖尿病大鼠模型的建立

大鼠腹腔注射STZ溶液7 d后,檢測大鼠血糖值,94%的大鼠符合血糖值>15 mmol/mL,模型建立成功。

2.3 復方北冬蟲夏草對糖尿病大鼠體重的影響

由圖7結果提示,與空白組相比,模型組體重極顯著降低(P<0.01);與模型組比較,復方北冬蟲夏草提取物高劑量組體重顯著提高(P<0.05),低、中劑量組體重雖有上升趨勢,但不顯著(P>0.05),說明復方北冬蟲夏草提取物具有改善糖尿病大鼠質量的作用。STZ誘導的糖尿病具有嚴重的體重減輕特征,這可能是因為肌肉和脂肪細胞組織退化以補償能量損失[14],糖尿病作為一種長期代謝紊亂的疾病,長期病理狀態下,高血糖及其并發癥嚴重影響糖尿病大鼠身體狀況及正常生活水平,因此復方北冬蟲夏草提取物能夠改善糖尿病大鼠的體重。

圖7 復方北冬蟲夏草提取物對大鼠體重的影響

2.4 復方北冬蟲夏草對大鼠血糖值及胰島素含量的影響

糖尿病是一種代謝性疾病,其特征是血液中葡萄糖水平升高以及體內胰腺分泌的胰島素不足或功能性障礙[15],胰島素是胰腺β細胞中響應各種刺激(例如葡萄糖、磺酰脲和精氨酸)而合成的一種蛋白質[16],體內胰島素分泌不足或對胰島素的抵抗會降低組織對葡萄糖的攝取,從而導致細胞內低血糖和細胞外高血糖。細胞內低血糖會導致糖原異生和糖異生,導致脂肪分解,形成糖尿病性酮癥酸中毒,而細胞外高血糖則導致高血糖昏迷和滲透性糖尿病[17],因此觀察血糖和胰島素的含量變化在糖尿病治療中至關重要。由表3可知,給藥治療12周后,與空白組相比,模型組大鼠血糖值極顯著升高(P<0.01),血清中胰島素含量極顯著降低(P<0.01),再次證明STZ誘導1型糖尿病大鼠模型建立成功;與模型組相比,復方北冬蟲夏草提取物中劑量組大鼠血糖值顯著下降(P<0.05),高劑量組血糖值極顯著下降(P<0.01),中、高劑量組大鼠胰島素含量均顯著升高(P<0.05),而低劑量組血糖值有降低趨勢、血清中胰島素含量有升高趨勢,但無統計學意義(P>0.05),說明復方北冬蟲夏草提取物具有改善糖尿病胰島機能的作用,這一作用效果與給藥劑量密切相關。

表3 各組大鼠血糖值及血清胰島素含量(n=10)

2.5 復方北冬蟲夏草對大鼠肝臟MDA含量、SOD及GSH-Px活力的影響

高血糖會通過葡萄糖自氧化作用增加ROS的產生,進而增加脂質氧化[18],而過量的ROS超出人體可清除的能力,會損壞細胞大分子,引起蛋白質糖基化和氧化變性,對細胞結構產生氧化應激損傷[19-20]。根據Antonio等[21]和Fukuda等[22]的研究,MDA是由于脂質過氧化作用而形成的,脂質過氧化作用可在脂質過氧化物與硫代巴比妥酸反應后用于測量脂質過氧化物,MDA含量常常可以反映機體內脂質過氧化的程度。由圖8所示,與空白組相比,模型組大鼠肝臟MDA含量極顯著升高(P<0.01),與模型組相比,復方北冬蟲夏草低劑量組MDA含量顯著下降(P<0.05),中、高劑量組MDA含量極顯著下降(P<0.01),說明模型組脂質過氧化作用過激,經治療后得到改善。

圖8 復方北冬蟲夏草提取物對MDA含量的影響

谷胱甘肽和SOD是糖尿病中氧化應激的生物標志物,糖尿病引起谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的改變,這些酶將過氧化物代謝為水,并將谷胱甘肽二硫化物轉化回谷胱甘肽[15],其水平的任何改變都將使細胞易于產生氧化應激并因此損害細胞。SOD是體內抗氧化防御系統的主要金屬酶,通過催化氧氣代謝中ROS超氧化物與分子氧和過氧化物的比例,將超氧化物分解為其他毒性較小的化合物[23-24],維持機體氧化平衡。由圖9、圖10所示,與空白組相比,模型組大鼠SOD和GSH-Px活力極顯著下降(P<0.01),說明隨著發病時間的推移,糖尿病大鼠氧化平衡破壞,氧化應激嚴重紊亂,與模型組相比,復方北冬蟲夏草低、中劑量組SOD活力顯著增加(P<0.05),高劑量組SOD活力極顯著升高(P<0.01);而三個劑量組大鼠GSH-Px活力均顯著升高(P<0.05),這與梁勇剛[25]對穿心蓮內酯注射液對1型糖尿病大鼠氧化應激的研究結果相一致,表明復方北冬蟲夏草提取物可提高糖尿病大鼠的氧化應激水平,具有明顯的抗氧化能力。

圖9 復方北冬蟲夏草提取物對SOD活力的影響

圖10 復方北冬蟲夏草提取物對GSH-Px活力的影響

2.6 復方北冬蟲夏草對大鼠腎臟TG、TC含量的影響

長期處于糖尿病狀態下,可導致調節脂肪酸氧化的關鍵酶表達下降,進而導致機體脂代謝異常[26]。根據夏惠[27]的研究,TG、TC作為脂代謝的重要指標,其含量的增加是導致脂代謝紊亂的原因之一,也是糖尿病大鼠腎功能惡化的重要因素。由圖11、圖12可知,與空白組相比,模型組糖尿病大鼠腎臟中TG和TC含量均極顯著提高(P<0.01),表明模型組大鼠脂代謝異常;與模型組相比,復方北冬蟲夏草低、中劑量組TG、TC含量顯著下降(P<0.05),高劑量組TG、TC含量極顯著下降(P<0.01),說明經給藥經治療后,大鼠脂代謝有所改善,且呈劑量依賴性增強。

圖11 復方北冬蟲夏草提取物對TG含量的影響

圖12 復方北冬蟲夏草提取物對TC含量的影響

2.7 復方北冬蟲夏草對大鼠腎臟組織形態的影響

由圖13可見,空白組大鼠腎臟包膜完整,腎小球結構清晰完整,且未見結構或大或小變化,腎小管上皮細胞無變性跡象,管腔內無滲出物;而模型組大鼠腎臟出現腎小球體積增大,形狀不規則,腎小球毛細血管袢及腎小管基底膜增厚,系膜細胞增殖,腎小球系膜基質增生,腎小體減少,這與杜時晶[28]對于1型糖尿病大鼠腎臟的病理形態描述相符;低劑量組腎小球形狀規則,結構較為清晰,中劑量組腎小體增多,高劑量組腎小球雖形態偏大,但形態結構較為完整,腎小管基底膜基本恢復,腎小體增多。表明復方北冬蟲夏草提取物可改善糖尿病大鼠的腎損傷。

圖13 大鼠腎臟組織形態學比較(HE×400)

3 結論

本研究采用水煎煮法提取復方北冬蟲夏草,通過單因素試驗和正交試驗篩選并優化復方北冬蟲夏草的最佳提取工藝:料液比1∶10 g/mL,提取3次,每次1.5 h,提取溫度為70 ℃,此工藝條件下的平均提取率為53.1%,平均多糖得率為5.1%,平均總皂苷得率為1.3%。大鼠經STZ誘導給藥后,與空白組比較,大鼠體重極顯著下降(P<0.01),糖尿病典型特征血糖水平極顯著升高(P<0.01),且胰島素含量極顯著降低(P<0.01),說明1型糖尿病模型建立成功;與模型組相比,復方北冬蟲夏草提取物高劑量組糖尿病大鼠的體重、胰島素水平和GSH-Px活力均顯著提高(P<0.05),SOD活力極顯著提高(P<0.01),而血糖值、肝臟MDA及腎臟TG、TC水平則極顯著降低(P<0.01),并從組織學上證明復方北冬蟲夏草提取物可有效改善糖尿病大鼠的腎損傷程度。

綜上所述,復方北冬蟲夏草提取物對糖尿病大鼠具有良好的降血糖作用,其降糖機制可能與改善機體氧化應激水平和影響脂代謝途徑相關,其具體信號通路需要進一步研究。本研究結果將為開發北冬蟲夏草系列產品提供理論基礎。