響應(yīng)面法優(yōu)化小黃姜中姜辣素的提取工藝

董加寶，夏應(yīng)書，岑順友，吳亞軍

(貴州黔棠姜生物科技有限公司，貴州 安順 561200)

生姜有小種姜、大種姜、山姜等品種，藥典記載藥用以小種為好，習(xí)慣把小種生姜叫“小黃姜”，小黃姜切面純黃色，味辛辣濃，肉細(xì)嫩，味香，纖維細(xì)而少。北緯27°附近是公認(rèn)天然的優(yōu)質(zhì)小黃姜產(chǎn)業(yè)帶。生姜中最重要的辛辣成分為姜辣素，其具有抗氧化，抑制胃黏膜損傷，保肝利膽，鎮(zhèn)痛解熱，以及抗衰老、抗腫瘤等主要藥理作用[1],姜辣素也是生姜多種功能活性的主要功能因子，在醫(yī)藥、食品、調(diào)味品、化妝品和衛(wèi)生等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。目前對生姜中姜辣素的提取方法主要有有機(jī)溶劑法[3]、超聲輔助溶劑法[4]、微波輔助溶劑法[5]、酶輔助提取法[6]、協(xié)同輔助提取法[7]等，但尚未見有針對鎮(zhèn)寧小黃姜中姜辣素的提取研究，為探明小黃姜中姜辣素的含量及工業(yè)化提取生產(chǎn)技術(shù)，本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化貴州鎮(zhèn)寧縣小黃姜中的姜辣素提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黃姜：產(chǎn)地安順鎮(zhèn)寧縣(貴州黔棠姜生物科技有限公司基地種植)，洗凈后于75℃條件下干燥60 min，然后切成2～3 mm薄片置于40℃烘干24 h，再經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，備用；香草醛標(biāo)準(zhǔn)品，成都市科龍化工試劑廠；95%乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003N電子天平(上海菁海儀器有限公司)；FW177粉碎機(jī)(湖南東晟電子有限公司)；DZF-6050真空干燥箱、SHB數(shù)顯三用恒溫水箱(鞏義市英谷高科儀器廠)；UV2800紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 小黃姜姜辣素提取單因素試驗(yàn)

不同乙醇濃度對姜辣素的提取效果：精確稱取小黃姜姜粉7份，按料液比1∶20g/mL分別加入體積分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇溶劑，室溫下振蕩浸提20 min后，取浸提液過濾，測定提取率。

不同料液比對姜辣素的提取效果：精確稱取小黃姜姜粉6份，按1∶10、1∶14、1∶18、1∶22、1∶26、1∶30g/mL加入80%乙醇溶劑，在室溫下震蕩浸提20 min，取浸提液過濾，測定提取率。

不同溫度對姜辣素的提取效果：精確稱取小黃姜姜粉5份，分別在20，30，40，50和60℃的溫度下，加入80%乙醇，振蕩浸提20 min后，取浸提液過濾，測定提取率。

不同時間對姜辣素的提取效果：精確稱取小黃姜姜粉5份，振蕩提取時間分別為10，15，20，25和30 min，取浸提液過濾后測定提取率。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化提取條件

以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，以小黃姜姜辣素提取率為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.5 樣品姜辣素含量的測定

參照廖欽洪的方法[3]：準(zhǔn)確稱取 0.2 g姜粉于30 mL具塞刻度試管中，加入一定濃度的乙醇，在指定的溫度下，于水浴鍋中浸提一定時間，冷卻、定容、過濾，得到姜辣素溶液。然后參照徐麗萍[8]的測定方法，代入香草醛回歸方程求出相應(yīng)濃度C，按下式即可計算出姜辣素的得率：

式中：2.001—香草醛換算姜辣素的系數(shù)；C—測定的A值在回歸方程中求出的香草醛濃度，μg/mL；V1—測定產(chǎn)品樣液總體積，mL；V0—產(chǎn)品提取液總體積；V2—測定時吸取的樣品液體積，mL；W—樣品體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑體積分?jǐn)?shù)對小黃姜姜辣素提取率的影響

由圖1可知，小黃姜姜辣素的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加先上升后趨于緩慢下降，當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到 80%時，提取率達(dá)到峰值13.28 mg/g。姜辣素主要含有姜酚類、姜烯酚類、姜酮類、姜油酮類、姜二酮類、姜二醇類物質(zhì)，通常姜酚類含量最高，姜酚屬于中等極性的物質(zhì)，緩慢增加乙醇濃度后溶液的極性變小，更有利于姜辣素的溶出，通常情況75%乙醇對細(xì)胞的滲透力最強(qiáng)，生姜細(xì)胞中的色素、雜質(zhì)等脂溶性成分的溶出量也會增加[9]，80%乙醇效果最好可能是生姜粉含有部分水份導(dǎo)致的，乙醇濃度高于80%后因其對小黃姜中的纖維等雜質(zhì)的細(xì)胞的滲透力有所降低，致使提取率開始逐步下降，因此選擇乙醇體積濃度80%來提取小黃姜姜辣素為宜。

圖1 不同溶劑濃度對小黃姜姜辣素提取率的影響

2.2 不同料液比對小黃姜姜辣素提取率的影響

由圖2可以看出料液比在1∶10～1∶18(g/mL)之間時，小黃姜姜辣素的提取率直線上升且上升幅度較大，在1∶18～1∶22(g/mL)之間上升較為平緩，1∶22(g/mL)后提取率基本處于不變狀態(tài)，說明小黃姜中姜辣素基本釋放完畢。綜合考慮料液比選用1∶22(g/mL)為宜。

圖2 不同料液比對小黃姜姜辣素提取率的影響

2.3 不同提取溫度對小黃姜姜辣素提取率的影響

由圖3可以看出在30～50℃姜辣素提取率有緩慢上升的趨勢，但提取溫度高于50℃后溫度越高提取率減少幅度越大。姜辣素化學(xué)性質(zhì)較為活潑，穩(wěn)定性較差，容易與氧氣反應(yīng)，且其重要組成姜酚在高溫條件下容易分解。秦天[10]的研究表明: 姜辣素在60℃會出現(xiàn)快速降解，而在25℃時經(jīng)7.5 h后姜辣素降解都不到10%。故對小黃姜姜辣素提取宜采用不超過50℃的溫度。

圖3 不同提取溫度對小黃姜姜辣素提取率的影響

2.4 不同提取時間對小黃姜姜辣素提取率的影響

圖4 不同提取時間對小黃姜姜辣素提取率的影響

由圖4可得出溫度在10～20 min時小黃姜姜辣素提取率隨著時間的延長而緩慢增加，但20 min以后姜辣素反而逐步下降，可能是在50℃長時間提取時姜辣素遇高溫降解，故工藝上在50℃提取小黃姜姜辣素時控制時間不宜超過20 min。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化小黃姜姜辣素的提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

由于料液比在1∶22(g/mL)時提取率基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而溶劑的濃度變化、溫度的波動、提取時間的變化對小黃姜姜辣素提取率有雙向影響，故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)按表1對虎杖中大黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.5.2 數(shù)據(jù)模型建立與回歸分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件三因素三水平 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到回歸方程為：

Y=14.01-0.017A-0.015B+0.058C- 0.06AB-0.01AC+0.21BC-0.18A2-0.022B2-0.002C2

一次項(xiàng)系數(shù)值的大小可以反映因素對響應(yīng)值的影響程度，由回歸方程可得出提取小黃姜姜辣素的主次影響因素順序?yàn)椋航釡囟?乙醇體積分?jǐn)?shù)>浸提時間。

2.5.3 回歸模型的方差分析

為進(jìn)一步確定模型可靠性，通過軟件得到的模型方差分析結(jié)果和各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中可知，模型中p<0.01，說明此次試驗(yàn)采用的二次模型是十分顯著的。pA、pC、pA2、pB2、pC2的值均小于0.05，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與三個因素的二次項(xiàng)均具有顯著影響；而提取時間的交互項(xiàng)較差。失擬項(xiàng)p=0.0079<0.05，表明有失擬因素存在，各因素的效應(yīng)關(guān)系為乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時間。

表3 回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.5.4 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面的坡度陡峭程度說明影響因素對響應(yīng)值的影響大小[11]。從3D響應(yīng)面圖(圖5～7)可以看出各個因素對姜辣素提取得率的影響程度。圖7的響應(yīng)面較為陡峭，說明提取時間和浸提溫度的交互作用較大，但是由表3可知在設(shè)定的提取條件范圍內(nèi)，三個交互作用均未達(dá)到顯著性水平。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對小黃姜姜辣素提取的交互作用

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對小黃姜姜辣素提取的交互作用

圖7 提取時間和提取溫度對小黃姜姜辣素提取的交互作用

2.5.5 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件回歸方程對小黃姜姜辣素的提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，由軟件分析得到最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)77.46%、提取時間15.94 min、提取溫度48.24℃、料液比1∶22 (g/mL)。結(jié)合實(shí)際條件，最佳工藝選取77.5%乙醇、提取溫度48℃、提取時間16 min、料液比1∶22 (g/mL)，經(jīng)3次平行試驗(yàn)測得平均提取率為14.22 mg/g，與預(yù)測值14.2475 mg/g相近，相對誤差為0.19%。采用響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖中大黃素提取工藝條件是合理可行的。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化小黃姜中姜辣素的提取工藝參數(shù)，得到小黃姜姜辣素的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)77.5%、提取溫度48℃、提取時間16 min、料液比1∶22 (g/mL)。在此條件下小黃姜姜辣素提取得率可達(dá)14.22 mg/g。