基于16S rRNA基因測序的尋常型銀屑病患者腸道菌群差異研究

王麗瑋 徐浩翔 段志敏 崔盤根 龔春燕 李岷

中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院皮膚科，南京210042

銀屑病是一種免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，尋常型銀屑病最為常見［1］。銀屑病的發病與多種因素有關。腸道菌群是生活在人類消化道中的復雜微生物群落［2］，被證實與肥胖、代謝綜合征［3］、類風濕性關節炎［4］等自身免疫性疾病有關。有研究報道腸道菌群與銀屑病密切相關［5?7］，本文探究江蘇地區成年尋常型銀屑病患者與健康人腸道菌群的差異。

對象與方法

一、對象

2017 年9 月至2018 年2 月中國醫學科學院皮膚病醫院住院治療的銀屑病患者，以本院健康體檢的員工及周邊居民為健康對照。依據中華醫學會《臨床診療指南：皮膚病與性病分冊》［8］指導診斷，并完成銀屑病面積和嚴重程度指數（psoriasis area and severity index，PASI）評分。納入標準：①銀屑病患者及健康人均需為南京市及周邊縣市常住居民，近1年無外地久居經歷；②未合并消化道出血、糖尿病、高血壓等其他已知影響腸道菌群的系統性疾??；③1 個月內無痔瘡發作、腹瀉等影響糞便形態及主要成分的事件；④1 個月未使用抗生素、活菌類制劑；⑤未在產褥期、哺乳期及妊娠期；⑥受試者配合采集標本前1周不使用類固醇制劑、免疫抑制劑、中草藥及其他可能影響消化道菌群的制劑，不服用酸奶、米酒及其他活菌類食品。本研究通過中國醫學科學院皮膚病醫院醫學倫理委員會批準［批號：（2017）臨審第（022）號］，所有受試者均簽署知情同意書。

二、糞便標本采集

取無菌袋采集受試者的新鮮糞便，立即放入冰盒后轉移入實驗室取樣，2 h 內分裝于1.5 ml 無菌離心管，置-80 ℃冰箱凍存，干冰凍存運送至蘇州協云基因科技有限公司實驗室。

三、DNA提取與擴增及16S rRNA基因測序

依據糞便基因組DNA 提取試劑盒［DP328，天根生化科技（北京）有限公司］提取樣本DNA。DNA 樣本經Qubit2.0 熒光定量（美國Invitrogengon公司）驗證后，選擇16S rRNA的V3-V4高變區對應基因序列作為擴增和測序的目的片段。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，341 正向引物：5′?CCTAYGGGRBGCASCAG?3′；806 反向引物：5′?GGACTACHVGGGTWTCTAAT?3′。使用PCR 試劑盒（美國Biosystems 公司）擴增，擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物利用瓊脂糖凝膠電泳，選擇465 bp 長度條帶，割膠并回收純化目標條帶。

將擴增溶液等濃度導入測序儀（美國Illumina公司），采用雙端2×300策略測序，并利用MiSeq控制軟件進行圖像分析和數據轉化。

四、數據分析

對獲得的原始Reads 進行拼接、質控后得到Tags，使用Usearch 軟件（Version 8.1.1861），基于基因組在線數據庫（Gold）過濾嵌合體序列，獲得有效Tags 后，使用QIIME 軟件（Version 1.9.1）按照大于97% 的相似性聚類為一個分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）。

1.稀釋曲線構建：以樣品測序量為橫坐標，對應的OTU 數目為縱坐標構建稀釋曲線，稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新OTU；反之表明不飽和，增加數據量可以發現更多OTU。

2.α 多樣性分析：α 多樣性指生境群落內微生物群落的豐度和多樣性；采用QIIME軟件計算OTU數目及α 多樣性主要指數Chao1 指數、Shannon 指數和Simpson 指數。Shannon 指數用于估算樣品中微生物多樣性，指數值越高，表明群落的多樣性越高；Chao1 指數用于估計物種總數，值越大代表物種總數越多；Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。

3.β 多樣性分析：β 多樣性指生境群落間微生物群落的差異；PCoA 分析可從復雜的多維變量數據中提取主要變量行降維至2 個變量并建立主要坐標，對整體樣本進行簡化的數據描述；以對組間差異貢獻最大的兩個變量值（第一主成分PC1、第二主成分PC2）分別作為橫坐標及縱坐標定位每一樣品，并分別注釋主成分對整體組間差異的解釋度；采用置換多元方差分析兩組群落組成結構差異，P<0.05為差異有統計學意義。

4. 菌群分布及差異分析：對照Silva 數據庫（Release 119）進行物種注釋和分類，采用秩和檢驗分析各層級樣本物種差異。采取線性判別分析效應量（linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）分析［9］確定最有可能解釋類別之間差異的特征物種，對數據進行降維、評估差異顯著的物種的線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）積分，定義LDA 評分大于2 且具有統計學差異的物種可以作為生物標志物；LEfSe 分析結果以條形圖展示LDA評分結果，以進化分枝樹圖展示微生物標志物的物種之間的進化關系；以總豐度為1計算厚壁菌門及擬桿菌門相對豐度并計算其比值，以中位數（P25，P75）表示。

五、統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件，通過Kolmogorov?Smirov檢驗變量是否服從正態分布，正態分布樣本資料以±s 表示，采用Welch′s t 檢驗，非正態分布樣本采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、臨床資料

尋常型銀屑病患者22 例，男16 例，女6 例，年齡19 ～65歲；健康對照組23例，男17例，女6例，年齡25 ～60 歲；兩組之間性別構成比、年齡、體質量指數（BMI）差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。銀屑病組中2例女性、4例男性靜脈血尿酸值增高，1例男性十余年前因外傷切除脾臟，余患者及健康對照均無系統疾病。所有受試者均無銀屑病家族史。

二、α多樣性分析

稀釋曲線顯示（圖1），隨著樣品測序量的增大，檢測到的物種種類隨之增加，在測序至30 000序列以上后，新增OTU的數量均趨于穩定。

組別銀屑病組健康對照組t值P值例數22 23年齡（歲）37.32±15.59 36.87±11.86 0.11 0.914 BMI（kg/m2）23.88±3.21 22.78±2.72 1.24 0.221

銀屑病組OTU 數目（147.55±57.07）與健康對照組（148.96±50.45）比較，差異無統計學意義（t=0.09，P = 0.930）；銀屑病組Shannon 指數（4.08 ±0.80）、Chao1 指數（169.52 ± 63.17）、Simpson 指數（0.87 ± 0.07）與健康對照組（分別為4.11 ± 0.94、175.36±53.59、0.86±0.90）比較，差異均無統計學意義（t=0.12、0.34、0.27，均P>0.05）。見圖2。

三、β多樣性分析

PCoA分析顯示（圖3），銀屑病組與健康對照組的第一主成分解釋度為49.8%，第二主成分解釋度為15.62%。置換多元方差分析顯示，兩組群落組成結構差異有統計學意義（P=0.011）。

四、菌群分布及差異分析

1.菌門的相對豐度分析：兩組共45個樣品中，占主要比例的菌門相對一致，為厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、梭桿菌門；不同樣本的菌門組成差異較大。見圖4。

2.LEfSe 分析：銀屑病組顯著升高且具有生物標志物作用的物種有厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目，丹毒絲菌目、丹毒絲菌科；健康對照組顯著升高的生物標志物物種有艾普西隆變形桿菌綱、彎曲桿菌目、彎曲桿菌科、彎曲桿菌屬，擬桿菌目、擬桿菌科（圖5A）。

具有微生物標志物的物種進化關系如下：厚壁菌門-梭菌綱-梭菌目，厚壁菌門-丹毒絲菌所屬綱-丹毒絲菌目-丹毒絲菌科，變形桿菌門-艾普西隆變形桿菌綱-彎曲桿菌目-彎曲桿菌科-彎曲桿菌屬，擬桿菌門-擬桿菌綱-擬桿菌目-擬桿菌科（圖5B）。

3.高尿酸血癥對銀屑病患者的影響：6 例伴高尿酸血癥與16 例無高尿酸血癥患者的年齡、BMI、PASI 評分差異無統計學意義（P > 0.05），見表2。兩組間厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度及其比值差異均無統計學意義（P>0.05）。

例數6 16年齡（歲，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）BMI（kg/m2，images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）組別有高尿酸血癥無高尿酸血癥t值/Z值P值PASI（images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s）43.33±22.15 35.06±12.52 1.115 0.278 25.28±3.55 23.36±3.02 1.275 0.217 20.18±4.77 21.83±4.07 0.812 0.426厚壁菌門［中位數（P25，P75）］0.57（0.37，0.88）0.58（0.34，0.73）0.696 0.717擬桿菌門［中位數（P25，P75）］0.33（0.09，0.58）0.29（0.16，0.63）0.522 0.948厚壁菌門/擬桿菌門［中位數（P25，P75）］2.77（0.69，10.90）2.29（0.54，3.52）0.653 0.788

討論

本研究利用16S rRNA基因測序技術分析22例成年尋常型銀屑病與23例成年健康對照組的腸道細菌群，研究納入的銀屑病患者與健康對照之間的性別分布相似，年齡及BMI 差異無統計學意義，具有可比性。有學者曾指出［10］，不同國家的個體之間糞便微生物群的系統發育組成存在顯著差異，在同一種族中，細菌群落的系統發育組成在出生后3年內逐漸演變成成人樣構型，兒童之間的人際差異明顯大于成人，因此本研究只納入漢族成人樣本；在樣本采集中充分考慮了地域飲食習慣、治療方案、影響腸道菌群的慢性疾病、下消化道疾病、短期內影響腸道菌群的飲食因素，采取無菌袋收樣，與國際上研究人源腸道菌群的標本采集原則一致［11］。

有研究發現，在關節型銀屑病及尋常型銀屑病中均可觀察到腸道細菌群的多樣性較健康人顯著下降［12］，這一結論在其他研究中并未能重復，部分研究中銀屑病患者的腸道菌群α 多樣性可呈現出下降趨勢［5?7］。本研究發現，尋常型銀屑病患者與健康人腸道菌群α多樣性無差別，但菌群總數較健康人有顯著降低，這與部分既往研究一致［7，13］。目前關于α多樣性和菌群總量的研究結果并不一致，這種差異可能是由于研究對象、采樣條件與研究技術的不同造成。在PCoA分析中，樣品距離越遠，表示物種組成結構差異越大，本研究中銀屑病組與健康對照組第一主成分與第二主成分解釋度之和>50%，置換多元方差分析兩組間β 多樣性差異顯著，提示銀屑病與健康人的腸道菌群具有顯著的組間菌群差異，表明銀屑病患者的腸道菌群較健康人群總體發生了可以被檢測出的變化，且這種變化趨勢為菌群總量或多樣性的降低。

關于豐度差異的具體菌群，本研究發現，在銀屑病組中顯著升高的有厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目，丹毒絲菌目、丹毒絲菌科；在健康對照組顯著升高的物種有艾普西隆變形桿菌綱、彎曲桿菌目、彎曲桿菌科、彎曲桿菌屬，擬桿菌目、擬桿菌科。Scher等［12］通過16S rRNA基因高通量測序及微生物數據庫比對分析發現，31 例銀屑病患者的糞便樣本中糞球菌屬種類減少。我國研究［6］發現，銀屑病患者糞便標本中阿克曼氏菌的豐度較健康人顯著降低；另一項研究中［7］，銀屑病患者糞便中普拉氏梭桿菌豐度較健康對照組顯著降低，而大腸桿菌豐度顯著增高。由于人群的局限性及腸道微生物組受人種、地域、性別、年齡等多種因素影響，目前臨床隊列研究數量及規模有限，對腸道細菌群的具體變化無法得出相對一致的結論。

但值得注意的是，本研究對于銀屑病及健康對照組中的差異菌群的統計方法與目前大多數類似的研究不同，已發表的文獻多采用單因素方差分析或非參數Kruskal?Wallis 秩和檢驗分析組間差異，本研究加入LEfSe 分析［14］，可充分考慮組內方差最小、組間方差最大的選擇。本研究通過菌種相對豐度排序得知，樣品間同一物種的相對豐度有較大差異，但相對豐度的優勢物種一致，厚壁菌門和擬桿菌門均為腸道菌群的主要菌群，與其他相關研究的結論一致［2］，通過LEfSe分析發現，銀屑病組顯著升高的具有生物標志物作用的物種為厚壁菌門。有研究提出，微生物可能通過多種方式促進代謝，包括修飾膽汁鹽及其產生來提高脂肪酸的生物利用度［15］，直接影響宿主的脂解活性，導致脂肪酸氧化速率降低，從而使更多的脂肪酸吸收［16］。厚壁菌門與肥胖密切相關，肥胖人群腸道菌群中擬桿菌門降低，厚壁菌門升高，在經歷飲食治療體重降低后，擬桿菌門的相對豐度增加，而厚壁菌門的豐度減少，并與飲食類型無關。在銀屑病患者中以肥胖、高尿酸血癥等代謝紊亂為臨床表現的代謝綜合征為常見的并發癥，是否因腸道菌群的改變導致或促進了銀屑病患者中代謝綜合征的發生還需更多證據。在本研究中伴與不伴發高尿酸血癥的銀屑病患者之間，BMI、PASI評分及厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度及比例差異均無統計學意義，腸道菌群與銀屑病患者中代謝綜合征的關系還需進一步人群隨訪及動物實驗驗證。

已有研究通過動物模型證明，干涉飲食及影響腸道菌群可影響疾病的發生與發展［17］，糞便移植也逐步用于疾病的治療［18］，我們的研究為進一步研究糞便移植或飲食干預治療銀屑病提供了可能的方案。本文的不足之處在于樣本量有限，雖嚴格控制變量，但研究對象局限于江蘇地區的健康人及銀屑病患者。目前銀屑病患者與健康人腸道菌群的構成及相對豐度在不同研究中存在較大的差異，可能與研究對象、檢測方法、技術差異與樣本量的限制有關，進一步研究腸道菌群與銀屑病的關系，有利于為探究銀屑病的發病機制及治療提供更多依據。

志謝蘇州協云基因科技有限公司

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