養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌細胞凋亡影響及作用機制

孫璽媛， 陳宏， 姜梅， 魏冬梅， 尹鋼， 陳沫嵐， 劉玲玲， 張杰

齊齊哈爾市第一醫院暨南方醫科大學附屬齊齊哈爾醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000

程序性死亡分子1（programmedcelldeath1，PD-1）及其配體程序性死亡分子配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）在腫瘤細胞免疫逃逸中發揮重要作用，是肺癌發生發展的機制之一，伴隨PD-1/PD-L1抗體在肺癌中的廣泛應用，使肺癌患者的無病進展生存期、總生存期得到了延長。PDL1 在腫瘤細胞高表達與T 細胞表面的PD-1 結合，使T細胞失能、耗竭，腫瘤細胞逃避T細胞的免疫監視和殺傷，進而增殖，病情惡化。腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡受細胞周期的調控[1]。養陰扶正方為臨床經驗總結方，由《溫病條辨》中的沙參麥冬湯化裁而來，具有益氣養陰、化痰通絡、散瘀解毒的功效。經過十余年的臨床使用，表明養陰扶正方能夠改善非小細胞肺癌患者的臨床癥狀、生存質量和穩定瘤灶，基礎研究也證明其具有明確的抗肺癌的作用[2-5]。因此，本研究應用免疫磁珠篩選PD-L1+Lewis 肺癌細胞，經過流式細胞術驗證后，建立移植瘤模型，研究其與原代Lewis 肺癌細胞在細胞凋亡以及細胞周期的差異及養陰扶正方的調控作用，為養陰扶正方的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與動物

Lewis 肺癌細胞株：購自美國ATCC 公司；C57BL/6 小鼠，雄性，48 只，鼠齡6 ～8 周，20 ±2 g/只，SPF 級，購于青島實驗動物中心（證書編號：SCXK 2014-0001），實驗動物使用許可證：SYXK（黑）2016004，本實驗通過《齊齊哈爾市第一醫院實驗動物管理辦法（試行）》倫理審核，倫理編號為NO.2018-01。

1.1.2 藥品

養陰扶正方由黃芪、黨參、沙參、天冬、麥冬、生白術、山藥、白花蛇舌草、拳參、絞股藍、茯苓、莪術組成，取以上藥加水煎煮二次，每次加10 倍量水，提取2 小時，濾過后合并濾液，制成5.25 克（生藥）/ml，以上藥品由齊齊哈爾市第一醫院試劑室提供。 阿特珠單抗（Atezolizumab，PD-L1 抑制劑）購自于美國基因工程技術公司。

1.1.3 試劑與儀器

細胞凋亡檢測試劑盒（批號：WLA001a）、細胞周期檢測試劑盒（批號：WLA010a）、全蛋白提取試劑盒（批號：WLA019）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：WLA004）、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒（批號：WLA013）、SDS-PAGE 電泳液（干粉）（批號：WLA026）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號：WLA005）、Bax antibody（批號：WL01637）、Bcl-2 antibody（批號：WL01556）、脫脂奶粉（批號：Q/NYLB 0039S）、羊抗兔IgG-HRP（批號：WLA023）、內參抗體β-actin（批號：WL01845）。

流式細胞儀（美國艾森生物公司）、Fresco低溫冷凍離心機、MultiSkan3酶標（Thermo公司）；Mini P-4 電泳槽、濕轉電泳槽（Cavoy）；分光光度計（Therno scientific）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystem）。

1.2 方法

1.2.1 PD-L1+Lewis 肺癌及Lewis 肺癌荷瘤鼠模型的建立

體外培養Lewis 肺癌細胞系，待細胞至增殖期，應用免疫磁珠分選出PD-L1+Lewis 肺癌細胞系。將PD-L1+Lewis 肺癌細胞系及Lewis 肺癌細胞系分別傳代培養，將密度為2×107個/L 的PD-L1+Lewis 肺癌細胞懸液及Lewis 肺癌細胞懸液分別接種于小鼠右側腋窩皮下（0.2 ml/只），分別構建PDL1+Lewis 肺癌/Lewis 肺癌荷瘤鼠模型。接種10 d后，待皮下移植瘤長至1 cm3左右，剝取1 只皮下移植瘤行病理檢測均為癌細胞，說明造模成功。

1.2.2 實驗分組

將造模成功的荷瘤鼠按隨機數字表法分為以下8 組，每組6 只。PD-L1+Lewis 肺癌荷瘤鼠分組：模型組（Control 1 組）、PD-L1 抑制劑組（阿特珠單抗，ATZ組）、養陰扶正方組（YYFZD組）、聯合組（養陰扶正方+阿特珠單抗，ATZ+YYFZD組）。Lewis 肺癌荷瘤鼠分組：模型組（Control 2組）、PD-L1抑制劑組（阿特珠單抗，ATZ組））、養陰扶正方組（YYFZD 組）、聯合組（養陰扶正湯+阿特珠單抗，ATZ+YYFZD組）。

1.2.3 給藥方式

1.2.3.1 模型組（Control 1組、Control 2組） 0.2 mL生理鹽水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理鹽水腹腔注射。

1.2.3.2 PD-L1 抑制劑組（ATZ 組） 0.2 mL 生理鹽水灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠單抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.2.3.3 養陰扶正湯組（YYFZD 組） 0.2 ml養陰扶正湯（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 mL生理鹽水腹腔注射。

1.2.3.4 聯合組（ATZ+YYFZD 組） 0.2 ml 養陰扶正湯（52 g/kg/d）灌胃，共10 d，第1 d、3 d、5 d 0.4 ml阿特珠單抗（60 mg/kg）腹腔注射。

1.3 流式細胞術檢測肺癌細胞調亡

停藥第2日頸椎脫臼處死各組荷瘤小鼠，無菌剝取瘤組織，PBS沖洗，制成單細胞懸液，分別收集每組細胞至離心管中，4 ℃下離心2 000 r/min 離心6 min，用預冷的PBS 洗滌細胞3 次，低溫下離心5 min，棄上清后加入結合緩沖液Bingbuffer重懸細胞，調整細胞濃度為2×105個細胞，加入5 ul膜聯蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）結合液輕輕混勻，在室溫下避光孵育10 min，加入5 ul碘化丙啶染色液，置于冰上遮光反應15 min，轉入流式細胞儀進行上機檢測，分析各組肺癌細胞凋亡率。

1.4 流式細胞術檢測肺癌細胞周期。

將1.3 制成的單細胞懸液，調整細胞濃度1 ×106/ml，1 000 g，5 min ，沉淀細胞加入1 ml 70%的冷乙醇固定2 h至過夜，染色前用預冷的PBS 洗去固定液。加入100 μl RNase A，37 ℃水浴30 min，加入500 μl 碘化丙啶染色液混勻，4 ℃避光30 min。流式儀檢測分析記錄激發波長488 nm 處紅色熒光。熒光信號變成電信號輸出至計算機，熒光染料與細胞DNA 特異性結合，檢測出細胞周期各個時像細胞比例。

1.5 Western-blot檢測瘤組織中Bcl-2、Bax的表達

瘤組織勻漿，抽提組織蛋白，測定蛋白濃度，加入電泳緩沖液，混勻，100 ℃煮沸5 min，每個樣分別取25 ug 上樣，4% ～10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉印至PVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1h 后加入相應一抗，4℃孵育過夜，PBS-T 洗滌3 次，每次5 min，分別加入羊抗兔或羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，PBS-T 洗滌3 次，每次10 min，ECL 顯影，以目的蛋白與內參蛋白βactin 光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 RT-PCR檢測瘤組織中Bcl-2、Bax的基因表達

①提取樣本總RNA。②紫外吸收測定法檢測濃度和純度，RNA的純度在1.8～2.2之間。③逆轉錄合成cDNA。④將所有cDNA 樣品分別配置Realtime PCR 反應體系。體系配置如下：2×Master Mix10 μl，10 uM 的PCR 特異引物F0.5 μl，10 uM的PCR 特異引物R0.5 μl，加水至總體積為18 μl，輕彈管底將溶液混合，5 000 rpm 短暫離心。⑤加樣：a將18 ul混合液加到96-PCR 板對應的每個孔中。b. 再加入對應的2 μl cDNA。c. 小心粘上Sealing Film 封口膜，并短暫離心混合。d.在設置PCR 程序前將準備好的PCR 板放在冰上。⑥將上述96-PCR 板置于Realtime PCR 儀上進行PCR 反應。按以下程序進行：95℃，30 秒；40 個PCR 循環（95 ℃，5 秒；60 ℃，40 秒）。為了建立PCR 產物的熔解曲線，擴增反應結束后，按95 ℃，10秒；60 ℃，60秒；95 ℃，15秒進行延伸；并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃（儀器自動進行-Ramp Rate 為0.05 ℃/秒）。⑦各樣品的目的基因和內參分別進行Realtime PCR 反應，每個樣本檢測3個復孔。數據采用2-△△CT法進行分析。

2 統計分析

3 結果

3.1 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞凋亡的影響

如表1、圖1 所示，Control 1 組凋亡率（88.35±1.64）%，Control 2 組凋亡率（87.16±1.85）%，兩組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組凋亡率比較，ATZ 組凋亡率升高，YYFZD 組凋亡率升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與ATZ 組凋亡率比較，ATZ+YYFZD 組凋亡率升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，與Control 2 組凋亡率比較，ATZ 組凋亡率升高，YYFZD 組凋亡率升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與ATZ 組凋亡率比較，ATZ+YYFZD 組凋亡率升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

表1 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞凋亡的影響（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表1 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞凋亡的影響（±s，%）Table 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①與Control 1組比較P ＜0.05；②與Control 2組比較，P ＜0.05；③與ATZ組比較，P ＜0.05

凋亡率PD-L1+Lewis肺癌（n=24）Control 1組88.35±1.64 YYFZD組96.08±1.85①ATZ組94.4±1.25①ATZ+YYFZD組95.32±1.45③Lewis肺癌（n=24）Control 2組87.16±1.85 ATZ+YYFZD組97.81±0.69③ATZ組95.46±1.18②YYFZD組96.67±0.90②

圖1 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞凋亡的影響Figure 1 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on the apoptosis of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

3.2 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞周期的影響

如表2、圖2 所示，Control 1 組G1 期細胞數（54.26±1.02）%、S 期細胞數（22.23±1.10）%、G2期細胞數（22.85 ± 0.76）%，Control 2 組G1 期細胞數（54.69 ± 1.10）%、S 期細胞數（21.26 ± 0.54）%、G2 期細胞數（23.66±0.60）%，兩組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組G1 期細胞數增多、S期、G2 期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與Control 1組比較，YYFZD組G1期細胞數增多、S 期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與ATZ 比較，ATZ+YYFZD 組G1 期細胞數增多，S 期、G2 期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌，與Control 2 組比較，ATZ 組G1 期細胞數增多、S 期、G2 期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與Control 2 組比較，YYFZD 組G1 期細胞數增多、S 期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與ATZ 比較，ATZ+YYFZD組G1期細胞數增多、S期、G2期細胞數減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

表2 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

表2 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis/Lewis lung cancer cells

注：①與Control 1組比較，P ＜0.05；②與Control 2組比較，P ＜0.05；③與ATZ組比較，P ＜0.05。

Lewis肺癌（n=24）Control組ATZ組YYFZD組ATZ+YYFZD組PD-L1+Lewis肺癌（n=24）G1期54.26±1.02 66.02±0.78①59.65±0.78①76.57±0.63①G2期23.66±0.60 20.43±0.62②17.77±6.01 12.60±0.69③S期22.23±1.10 13.64±1.02①17.16±0.52①8.03±0.71①G2期22.85±0.76 18.69±0.93①22.79±0.40 13.73±0.04③G1期54.69±1.10 65.36±0.59②61.61±1.31②77.69±1.23②S期21.26±0.54 12.85±0.85②15.92±0.57②7.23±0.40②

圖2 養陰扶正方對PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌細胞周期的影響Figure 2 Effect of Yangyin Fuzheng Recipe on cell cycle of PD-L1+Lewis lung cancer cell/Lewis lung cancer cell

圖3 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白相對表達量的影響。Figure 3 Relative expression of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.3 養陰扶正方對PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

如圖3、圖4 所示，Control 1 組和Control 2 組的Bcl-2、Bax 蛋白的相對表達量為（0.93 ± 0.04，0.85 ± 0.07）、（0.24 ± 0.06，0.20 ± 0.06），兩組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組Bcl-2 蛋白相對表達量（0.37 ± 0.06）減少，Bax 蛋白相對表達量（0.94±0.12）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對表達量（0.57±0.11）減少，Bax 蛋白相對表達量（0.61± 0.03）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，ATZ+YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對表達量（0.22 ± 0.06）減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，與Control 2比較，ATZ 組Bcl-2蛋白表相對達量（0.38±0.08）減少，Bax蛋白相對表達量（0.97±0.13）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。YYFZD 組Bcl-2 蛋白相對表達量（0.6±0.11）減少，Bax 蛋白相對表達量（0.99±0.12）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，Bcl-2 蛋白相對表達量（0.16 ± 0.04）減少，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

圖4 West-blot檢測PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2蛋白的水平Figure 4 Westblot analysis of Bcl-2 and Bax protein in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

3.4 養陰扶正方對PD-L1+ Lewis 肺癌/Lewis 肺癌Bax、Bcl-2基因表達的影響

如 圖5 所 示，Control 1 組 與Control 2 組 的Bax、Bcl-2 的mRNA 的相對表達量分別為（1.00 ±0.07，1.01±0.18）、（1.0±0.08，1.00±0.07），兩組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。在PD-L1+Lewis 肺癌中，與Control 1 組比較，ATZ 組Bcl-2mRNA 相對表達量（0.43 ± 0.03）減少，BaxmRNA相對表達量（4.2±0.43）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）；YYFZD 組Bcl-2mRNA 相對表達量（0.72 ± 0.05）減少，BaxmRNA 相對表達量（2.62 ±0.22）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與ATZ組比較，ATZ+YYFZD 組BaxmRNA 相對表達量（8.35 ± 0.40）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。在Lewis 肺癌中，與Control 2比較，ATZ 組Bcl- 2mRNA 表 相 對 達 量（0.29 ± 0.02）減 少，BaxmRNA相對表達量（4.23±0.49）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05），YYFZD 組Bcl-2 mRNA 相對表達量（0.65 ± 0.07）減少，BaxmRNA 相對表達量（2.62±0.07）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與ATZ 組比較，BaxmRNA 相對表達量（6.25±0.4）增多，差異有統計學意義（P ＜0.05）。

圖5 PD-L1+Lewis肺癌/Lewis肺癌各組荷瘤鼠Bax、Bcl-2mRNA相對表達量的影響Figure 5 Relative expression of Bcl-2 and Bax mRNA in lung carcinoma xenograft C57BL/6 mouse models of PD-L1+Lewis and Lewis lung cancer

4 討論

肺癌是世界上發病率和死亡率居均首位的惡性腫瘤，是導致癌癥相關死亡的最主要原因[6]。在惡性腫瘤中，我國的肺癌男性發病率居第一位，女性發病率居第二位，死亡率男、女均第一位[7]。肺癌的整體療效差，其原因之一仍在于肺癌細胞逃避了宿主的免疫監視和殺傷，導致了免疫逃逸的發生。PD-1及PD-L1 可表達于多種腫瘤表面的共抑制分子，其與腫瘤的發生、發展密切相關。研究表明，其在介導多種實體腫瘤細胞免疫逃逸中發揮重要作用。PD-1單抗以及PD-L1單抗在肺癌的治療中取得了較好的臨床療效，因此，本研究應用免疫磁珠法分選出PD-L1+Lewis細胞，研究其與Lewis細胞的生物學行為的差異。本研究結果顯示PD-L1+Lewis 細胞和Lewis 細胞在凋亡率、細胞周期、凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表達方面無差異，表明PD-L1+Lewis 細胞和Lewis 細胞的生物學行為相同，也就是說肺癌細胞表達PD-L1 并沒有增加肺癌細胞的惡性行為。

中醫理論認為腫瘤的本質是細胞水平上陰陽平衡失調，腫瘤細胞增殖失控（陽盛），凋亡不足（陰衰），細胞凋亡過少而增殖過多，陽盛陰衰形成腫瘤；當凋亡速度大于增殖速度，即陰陽趨向于動態平衡態，則惡性腫瘤消退[8]。本研究表明養陰扶正方促進PD-L1+Lewis 細胞和Lewis 細胞的凋亡，細胞周期阻滯于G1期，降低Bcl-2、增加Bax蛋白及mRNA 的表達。養陰扶正方通過益氣養陰，解毒散結，糾正了荷瘤的“陰衰”，促進了肺癌細胞的凋亡，即細胞增殖與凋亡趨向于“陰平陽秘”的動態平衡態，則惡性腫瘤自然消退。同時養陰扶正方可能作用G1、S 期的限制點，G1 期細胞數增多，S期細胞數減少，使細胞周期阻滯于G1 期，進入細胞周期的細胞數減少，發生凋亡的細胞數增多，抑制了腫瘤細胞的增殖。

阿特珠單抗是一種針對PD-L1 的選擇性人源化單克隆IgG1 抗體，作用于PD-L1，阻止其與PD-1的相互作用，阻斷T淋巴細胞負性調控的來源，逆轉腫瘤免疫耐受性并重新建立針對腫瘤細胞的適應性免疫應答，以此來達到免疫治療的目的。該藥用于Ⅲ、Ⅳ期NSCLC、無中樞神經系統轉移的NSCLC、經含鉑雙藥治療后進展的晚期非小細胞肺癌、Ⅳ期及新發轉移的非鱗NSCLC 的治療[9]。本研究表明阿特珠單抗可促進PD-L1+Lewis、Lewis 細胞的凋亡，將細胞周期阻滯于G1期，降低Bcl-2 的蛋白及mRNA 的表達，促進Bax的蛋白及mRNA 的表達，與養陰扶正方聯合應用，上述作用得到了加強，推測其機制可能是阿特珠單抗阻止肺癌細胞上的PD-L1與T細胞上PD-1 的相互作用，逆轉了肺癌細胞的免疫耐受，T 細胞的免疫功能得到了有效的發揮，同時養陰扶正方增強了阿特珠的功效，其機制將在后續的實驗中證實。

綜上所述，PD-L1+Lewis 肺癌、Lewis 肺癌細胞的生物學行為相同，養陰扶正方通過調節Bax、Bcl-2 蛋白及mRNA 表達，促進PD-L1+Lewis 肺癌細胞、Lewis肺癌細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G1期，增加了阿特珠單抗的療效，養陰扶正方與PD-L1抗體的聯合應用，為肺癌的治療提供了新的思路。