黃芪多糖對高氧致新生大鼠支氣管肺發育不良mir-34a/sirt1 軸的影響

丁波，李智敏，黃建玲

支氣管肺發育不良（Bronchopulmonary Dysplasia，BPD）是早產兒的一種慢性肺部疾病，肺發育不成熟是該病主要原因之一，肺功能受阻早產兒一般會置于氧環境中一定時間，但置于高氧環境中氧產生的毒素會直接損傷肺部［1］。研究發現，微小RNA-34a（microRNA-34a，mir-34a）/沉默信息調節因子 1（silent information regulator 1，sirt1）軸中 mir-34a 上調可抑制sirt1 蛋白的表達從而加快腦內炎癥反應［2］，上調mir-34a可促進過氧化氫引起的細胞氧化應激損傷，下調mir-34a可減緩氧化應激損傷［3］。黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）是中藥黃芪主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化藥理作用，可降低潰爛性結腸炎中炎性因子水平從而治療潰爛性結腸炎［4］，還可提高仔豬抗氧化能力改善疾病狀況［5］，但其對BPD大鼠肺損傷的作用尚未發現報道。本研究通過構建BPD模型，觀察APS對BPD大鼠肺組織中炎癥反應、氧化應激反應的影響并探討其作用機制，旨在揭示其保護BPD 大鼠肺損傷的分子機制。

黃芪多糖對高氧致新生大鼠支氣管肺發育不良mir-34a/sirt1 軸的影響

圖1 大鼠建模后肺組織形態學變化（HE×200） 圖2 免疫組化法檢測大鼠建模10、17 d肺組織中沉默信息調節因子1（sirt1）表達比較（HE×400）

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1實驗動物 將2018年1月至2019年1月參加實驗的健康SD大鼠由廣州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（粵）-2016-0143，清潔級，出生3 d體質量（9.45±0.25）g。實驗動物中心溫度（25±1）℃、濕度（60±10）%、12 h 黑暗12 h 光照常規飼養大鼠。所有實驗均經本院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 APS由天津華隆醫藥保健品有限公司提供，批準文號：Z20040085。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒由武漢百浩天生物科技有限公司提供，貨號：C0490。大鼠白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒由碧云天生物科技有限公司提供，貨號分別為：PI326、PI522、PT516。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 檢測試劑盒由上海紀寧實業有限公司提供，貨號分別為：N01762、N06457。一抗sirt1（抗鼠）、內參GADPH（抗鼠）、二抗羊抗鼠由英國abcam 公司提供，貨號分別為：ab110304、ab8245、ab150117。RNAisoPlus、cDNA 逆轉錄試劑盒、2×HiSYBR Green QPCR Mix 由日本Ta-KaRa 公司提供，貨號分別為：9108、DRR037A、ARR041A。蛋白裂解液由北京索萊寶科技有限公司提供，貨號：R0010。脫脂奶粉由美國BD 公司提供，貨號：232100。DAB 顯色試劑由上海生工生物工程有限公司提供，貨號：PW017。氧箱由美國Shellab 公司提供，切片機由德國Leica 公司提供，光學顯微鏡由日本Olympus 公司提供，實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀由美國ABI公司提供，蛋白凝膠成像儀由上海Tanon公司提供。

1.2 方法

1.2.1動物造模 參照文獻中方法建模［6］。將64只出生后3 d SD 大鼠按照隨機數字表法分為空白對照組（NC 組）、APS 對照組（APS 組）、高氧誘導BPD 模型組（BPD 組）、APS 治療 BPD 組（BPD+APS組），每組16 只。NC 組、APS 組大鼠暴露在空氣中常規飼養；BPD組、BPD+APS組大鼠置于氧箱中，氧濃度維持在（70±5）%，同時吸收氧箱二氧化碳和水蒸氣保持氧箱中壓力恒定，其余條件與NC 組、APS組相同。24 h 后APS 組和BPD+APS 組腹腔注射100 mg·kg-1·d-1APS，注射體積100 μL，劑量參考文獻［7］，NC 組和BPD 組腹腔注射同體積生理鹽水，直至大鼠處死。

1.2.2大鼠體質量變化 建模10 d 每組大鼠隨機抽取8 只，腹腔注射麻醉大鼠稱量體質量。建模17 d再次稱量。

1.2.3HE 染色觀察肺組織形態學變化 大鼠稱完體質量后立即處死大鼠，打開胸腔，部分肺組織置于4%多聚甲醛中做HE染色和免疫組化實驗，部分肺組織置于4 ℃冰箱做ELISA實驗，部分置于-80 ℃冰箱做qRT-PCR 和蛋白免疫印跡（Western blot）實驗。固定于4%多聚甲醛中的肺組織過夜后，轉至不同濃度乙醇中脫水，二甲苯中透明，石蠟中包埋、冷凍凝固后在切片機上切片。切片制作完成后經脫蠟、復水、染色，再脫水、透明、封片完成HE染色，光學顯微鏡拍照。

1.2.4ELISA檢測 大鼠肺組織中IL-6、IL-10、TNF-α、MDA水平和SOD活性置于4 ℃冰箱肺組織在收樣6 h內冰上組織勻漿，5 000 r/min 離心5 min，收集上清液分裝置于-20 ℃中待測。嚴格按照大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、SOD、MDA ELISA試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5qRT-PCR 檢測 大鼠肺組織中mir-34a 水平-80 ℃超低溫冰箱中每個樣品取50 mg 組織，RNAisoPlus 提取肺組織總RNA，cDNA 逆轉錄試劑盒反轉錄cDNA，qRT-PCR 儀對mir-34a、內參 U6 擴增。引物序列：mir-34a-F：5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3’，mir-34a-R：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG-3’；U6-F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，U6-R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。上樣體系：cDNA 1 μL（50 ng/μL），F/R（10 μM）各0.5 μL，2×Mix 10 μL，雙蒸水（ddH2O）8.0 μL。反應條件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，45個循環。2-ΔΔCT法計算肺組織中mir-34a表達水平。

1.2.6免疫組化檢測 大鼠肺組織中sirt1 表達水平變化制作好的切片按1.2.3中HE染色相同方法脫蠟、復水，滴加過氧化氫滅火內源性過氧化氫酶，熱修復抗原并加磷酸緩沖液沖洗，5%脫脂奶粉封片20 min，滴加一抗sirt1（1∶1 000）［陰性對照用同型同種鼠免疫球蛋白G（IgG）代替一抗］2 h，滴加二抗20 min后二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染核，鹽酸酒精分色，脫水、透明、封片。光學顯微鏡拍照。免疫組化結果鑒定：胞質中出現黃色或棕色顆粒為陽性。陽性評分由兩位病理科醫師協商判斷。陽性率0%～5%為陰性，6%～10%為弱陽性，11%～25%為陽性，＞26%為強陽性。

1.2.7蛋白質印跡法檢測 大鼠肺組織中sirt1 蛋白水平-80 ℃超低溫冰箱中每個樣品取30 mg 肺組織，使用高壓滅菌過的手術剪剪碎后，在冰上研磨，每管加1 mL 蛋白裂解液冰上裂解30 min，組織勻漿液10 000 g離心5 min，上清液即為肺組織總蛋白。蛋白定量后聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白質，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜280 mA 60 min 轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗sirt1（1∶10 000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）（1∶5 000）4℃孵育過夜；對應加入二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.3 統計學方法SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量數據均用±s表示，組內比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量變化NC 組與 APS 組建模 10、17 d 體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC 組、APS組對比，BPD組建模10、17 d體質量降低（P＜0.05）。與 BPD 組相比，BPD+APS 組建模 17 d 體質量增加（P＜0.05）。見表1。

表1 SD大鼠64只建模10、17 d體質量變化/（g，±s）

表1 SD大鼠64只建模10、17 d體質量變化/（g，±s）

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組。與NC組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC 組APS 組BPD 組BPD+APS 組F 值P 值鼠數16 16 16 16體質量建模10 d 22.17±3.41 22.21±3.19 17.46±2.66ab 20.17±4.32 3.380 0.032建模17 d 50.27±4.65 48.79±4.99 35.75±2.85ab 42.66±3.71c 20.516 0.000

2.2 大鼠肺組織形態學變化建模10、14 d，NC 組與APS 組大鼠肺組織氣管和各級支氣管結構完整，肺泡排列整齊，無間隔破壞，無炎癥細胞浸潤現象。BPD 組肺組織結構不完整，肺泡數量減少、體積增大，結構簡單化，炎癥現象明顯。BPD+APS 組肺組織結構較完整，肺泡發育較好，大小均勻，間隔較均勻，炎癥細胞浸潤現象減少，肺泡結構接近NC組和APS組。見圖1。

2.3 大鼠肺組織中IL-6、IL-10、TNF-α 水平變化建模10、17 d，NC 組和APS 組肺組織中IL-6、IL-10、TNF-α 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC組、APS組相比，BPD組建模10、17 d肺組織中IL-6、TNF-α 表達升高，IL-10 表達降低（P＜0.05）；BPD+APS組建模10 d肺組織中IL-10表達降低，TNF-α表達升高（P＜0.05）。與BPD 組相比，BPD+APS 組建模10、17 d肺組織中IL-6、TNF-α表達降低，IL-10表達升高（P＜0.05）。見表2。

表2 SD大鼠64只建模后肺組織中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較/（ng/L，±s）

表2 SD大鼠64只建模后肺組織中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較/（ng/L，±s）

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組，IL-6為白介素-6，IL-10為白介素-10，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。與NC組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC 組APS 組BPD 組BPD+APS 組F 值P 值鼠數16 16 16 16 IL-6建模10 d 143.62±44.62 144.37±48.31 211.32±47.68ab 159.66±39.17c 4.009 0.017建模17 d 137.82±39.21 143.66±42.02 218.66±48.04ab 152.22±31.08c 6.848 0.001 IL-10建模10 d 9.66±2.17 9.43±1.89 3.71±0.67ab 6.67±1.17abc 24.688 0.000建模17 d 9.17±1.75 9.19±1.66 3.42±0.53ab 8.17±1.25c 31.659 0.000 TNF-α建模10 d 276.65±66.05 274.18±57.15 496.52±81.91ab 357.77±65.31abc 18.721 0.000建模17 d 274.69±62.17 285.66±56.85 537.88±64.06ab 317.66±73.22c 29.686 0.000

2.4 大鼠肺組織中SOD 活性和MDA 水平建模10、17 d，NC 組和 APS 組肺組織中 SOD 活性和MDA水平表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC 組、APS組相比，BPD組建模10、17 d肺組織中SOD活性降低，MDA 表達升高（P＜0.05）；BPD+APS 組建模10 d 肺組織中 SOD 活性降低，MDA 表達升高，建模17 d 肺組織中SOD 活性降低（P＜0.05）。與BPD 組相比，BPD+APS 組建模 10 d 肺組織中 SOD 活性升高，建模 17 d 肺組織中 SOD 活性升高，MDA 表達降低（P＜0.05）。見表3。

表3 SD大鼠64只建模肺組織中SOD活性和MDA水平比較/±s

表3 SD大鼠64只建模肺組織中SOD活性和MDA水平比較/±s

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組，SOD為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛。與NC組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC 組APS 組BPD 組BPD+APS 組F 值P 值例數16 16 16 16 SOD/（U/mg）建模10 d 21.25±3.79 20.96±3.50 11.64±1.94ab 14.32±2.54abc 20.172 0.000建模17 d 23.66±4.05 22.18±4.18 8.96±1.95ab 16.95±3.45abc 28.467 0.000 MDA/（μmol/g）建模10 d 2.32±0.76 2.28±0.64 4.17±1.05ab 3.57±0.59ab 11.576 0.000建模17 d 2.39±0.81 2.47±0.56 4.32±0.95ab 2.86±0.71c 10.839 0.000

2.5 大鼠肺組織中mir-34a 表達水平變化建模10、17 d，NC 組與 APS 組肺組織中 mir-34a 差異無統計學意義（P＞0.05）。與 NC 組、APS 組相比，BPD組、BPD+APS 組肺組織中 mir-34a 表達升高（P＜0.05）；與BPD組相比，BPD+APS組肺組織中mir-34a表達降低（P＜0.05）。見表4。

表4 SD大鼠64只建模10、17 d肺組織中mir-34a表達水平比較/±s

表4 SD大鼠64只建模10、17 d肺組織中mir-34a表達水平比較/±s

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組，mir-34a為微小RNA-34a。與NC組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC 組APS 組BPD 組BPD+APS 組F 值P 值例數16 16 16 16 mir-34a建模10 d 1.00±0.12 1.01±0.15 2.38±0.47ab 1.62±0.38abc 33.917 0.000建模17 d 1.08±0.11 1.11±0.13 2.28±0.55ab 1.49±0.29abc 24.038 0.000

2.6 免疫組化法檢測大鼠肺組織中sirt1 表達水平變化棕色代表sirt1 陽性，蛋白定位于細胞質。NC組與APS組在建模10、14 d sirt1蛋白陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC 組、APS 組相比，建模10、14 d BPD組sirt1蛋白陽性表達率降低，BPD+APS 組sirt1 蛋白陽性表達率升高（P＜0.05）。與 BPD 組相比，BPD+APS 組建模 10、14 d sirt1 蛋白陽性表達率升高（P＜0.05）。見圖2、表5。

表5 SD大鼠64只建模10、17 d肺組織中sirt1陽性表達率比較/（%，±s）

表5 SD大鼠64只建模10、17 d肺組織中sirt1陽性表達率比較/（%，±s）

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組，sirt1 為沉默信息調節因子1。與NC 組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC組APS組BPD組BPD+APS組F 值P 值例數16 16 16 16 sirt1陽性表達率建模10 d 8.32±1.96 9.17±2.09 4.33±0.31ab 12.51±2.06abc 28.834 0.000建模17 d 28.59±2.66 28.37±2.52 3.68±1.03ab 31.67±2.15abc 283.835 0.000

2.7 蛋白質印跡法檢測大鼠肺組織中sirt1 表達水平變化NC組和APS組建模10、14 d肺組織中sirt1蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。與NC 組、APS組相比，BPD組建模10、14 d sirt1蛋白表達降低（P＜0.05）。與 BPD 組相比，BPD+APS 組建模 10、14 d sirt1蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖3、表6。

圖3 蛋白質印跡法檢測大鼠建模后肺組織中沉默信息調節因子1（sirt1）蛋白表達水平比較

表6 SD大鼠64只建模后肺組織中sirt1蛋白表達水平比較/±s

表6 SD大鼠64只建模后肺組織中sirt1蛋白表達水平比較/±s

注：NC組為空白對照組，APS組為黃芪多糖對照組，BPD組為高氧誘導支氣管肺發育不良模型組，BPD+APS組為黃芪多糖治療支氣管肺發育不良組，sirt1 為沉默信息調節因子1。與NC 組相比，aP＜0.05；與APS組相比，bP＜0.05；與BPD組相比，cP＜0.05

組別NC 組APS 組BPD 組BPD+APS 組F 值P 值例數16 16 16 16 sirt1建模10 d 1.01±0.25 1.09±0.26 0.11±0.06ab 0.94±0.14c 43.368 0.000建模17 d 0.98±0.24 1.11±0.23 0.15±0.05ab 1.02±0.18c 43.906 0.000

3 討論

BPD 多發生于早產兒，早產兒出生時體質量低、對氧的依賴性強，目前炎癥反應、氧化應激、宮內感染、氣壓傷等均會導致肺組織損傷和修復異常［8］。研究發現早產兒吸入高濃度氧時會增強肺組織炎癥，同時肺組織中出現大量的氧自由基，最終形成BPD［9］，目前尚無確切有效的治療方法。APS是豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根中經提煉、濃縮制成的，是黃芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗應激、抗衰老、抗腫瘤等作用，在BPD大鼠中可減緩炎癥水平從而改善BPD病理狀態［10］。本研究發現，建模10、17 d，APS組與NC組結果類似，體質量并未減輕，肺組織氣管和各級支氣管結構完整，肺泡排列整齊，無間隔破壞，無炎癥細胞浸潤現象，提示APS 對大鼠安全。建模10、17 d，與 APS 組與 NC 組比較，BPD 組大鼠體質量減輕，肺組織肺泡數量減少、體積增大，結構簡單化，炎癥現象明顯，提示高氧可導致新生大鼠體質量減輕、肺組織結構破壞，表明BPD 大鼠造模成功。與BPD 組比較，BPD+APS 組大鼠體質量增加，肺組織肺泡發育較好，大小均勻，間隔較均勻，炎癥細胞浸潤現象減少，與 NC 組和 APS 組類似，提示 APS 可緩解BPD造成的大鼠體質量減輕、肺組織結構損傷癥狀，但具體作用機制尚不清楚。

炎性因子是參與炎癥反應的細胞因子，其水平反映機體炎癥水平。在炎癥反應中，IL-6 能誘導急性炎癥反應、IL-10有抗炎作用、TNF-α是出現最早、最重要的炎癥介質［11］。研究顯示，機械通氣可致小鼠肺損傷支氣管肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α 水平升高、IL-10 水平降低，加快肺損傷［12］。本研究發現建模 10、17 d，NC 組和 APS 組肺組織中 IL-6、IL-10、TNF-α 表達差異無統計學意義，提示APS 本身不會增強正常大鼠肺組織炎癥反應。與NC組、APS組相比，BPD 組建模10、17 d 肺組織中IL-6、TNF-α 表達升高，IL-10表達降低，提示高氧誘導BPD 可提高大鼠肺組織中促炎因子、炎癥介質水平，降低抗炎因子水平從而增強機體炎癥反應。與BPD 組相比，BPD+APS組建模10、17 d肺組織中IL-6、TNF-α表達降低，IL-10 表達升高，提示APS 治療可減緩BPD 誘導的大鼠肺組織炎癥反應增強現象，減緩疾病進程。

SOD 活性和MDA 水平是最常見的兩種氧化應激指標，其水平反映機體氧化應激水平，氧化應激指體內氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，是導致疾病的一個重要因素［13］。SOD 是自由基清除酶，反映抗氧化水平，具有抗炎能力；MDA 是過氧化反應產物，可反應過氧化水平［14］。機械通氣致小鼠肺損傷支氣管肺泡灌洗液中SOD活性下降、MDA水平升高增強肺損傷［15］。本研究發現建模 10、17 d，NC 組和 APS 組肺組織中SOD活性和MDA水平表達差異無統計學意義，提示APS 不影響正常大鼠肺組織中氧化應激反應。與NC 組、APS 組相比，BPD 組建模 10、17 d 肺組織中SOD 活性降低，MDA 表達升高，提示 BPD 會使機體抗氧化能力降低，氧化水平升高，機體氧化應激反應增強。與BPD組相比，BPD+APS組建模10 d肺組織中SOD活性升高，建模17 d肺組織中SOD活性升高，MDA 表達降低，提示 APS 可緩解 BPD 誘導的氧化應激反應增強現象，緩解疾病進程。

miRNA是一種小分子非編碼RNA，活性與其靶基因結合性關系緊密，根據靶基因序列不同，其功能亦差別很大［16］。miR-34a在各種真核生物中廣泛存在，被認為是一種抑癌基因，可作用多個靶基因［17］；sirt1 是一種去乙酰化酶，是 mir-34a 的直接靶基因［18］，研究發現sirt1可作為獨立影響機制減弱炎癥反應、改善氧化應激及線粒體等功能障礙水平［19］。缺氧引起心肌細胞損傷會導致mir-34a上調、sirt1下調，從而加速心肌損傷；復氧后mir-34a下調、sirt1 上調可保護心肌細胞［20］。本研究發現，建模10、17 d，NC組與APS組肺組織中mir-34a、sirt1差異無統計學意義，提示APS 不影響正常大鼠肺組織中mir-34a/sirt1軸水平。與NC組、APS組相比，BPD組mir-34a 表達升高、sirt1 表達降低，提示 BPD 可誘導mir-34a表達升高作用靶基因sirt1降低表達水平，促使炎癥反應加劇、氧化應激水平升高。與BPD組相比，BPD+APS 組肺組織中mir-34a表達降低、sirt1表達升高，提示APS 可減緩BPD 誘導的mir-34a 升高、sirt1降低現象，降低mir-34a表達、升高sirt1表達，減弱炎癥反應、改善氧化應激，實現對BPD 大鼠肺損傷的保護作用。

綜上所述，APS可能通過抑制mir-34a表達促使其靶基因sirt1 上調，從而減緩炎癥反應、改善氧化應激狀態，減輕肺組織損傷，實現對BPD 大鼠肺組織的保護作用。

（本文圖1，2見插圖10-1）