水稻花藥培養技術及其研究進展

趙沙沙 田永宏 陳 波 房振兵 潘高峰

（湖北省襄陽市農業科學院，襄陽 441057）

水稻花藥培養是采用無菌操作技術，把發育到一定時期的水稻花藥接種到人工培養基上，通過改變花粉粒的發育程序誘導脫分化形成愈傷組織，然后使愈傷組織再分化形成單倍體植株的過程。單倍體植株經過秋水仙堿或自然加倍，成為完整的二倍體植株。將花藥培養與其他育種技術相結合，可以快速純合育種材料，有效縮短育種周期，提高選擇效率，加快育種進程[1]。

1 水稻花藥培養發展概況

日本學者新關（Niizeki）和大野（Oono）于1968年利用花藥培養技術首次獲得水稻單倍體植株[2]，開啟了水稻花藥培養研究的先河[3]。1970 年，我國開始水稻花藥培養的研究，并于1975 年第1 次利用花藥培養技術育成了粳稻新品種單豐1 號[4]。20世紀80 年代中期，研究者們開始將花藥培養技術應用于水稻育種，先后育成了中花系列、龍粳系列和花育系列等粳稻品種以及后續的其他品種[5]。但是應用花藥培養技術選育的秈稻品種還比較少，到20 世紀末僅有5 個，其中江西農科院4 個、江西農業大學1 個，推廣面積都不大[2]。目前，通過花藥培養技術育成的常規水稻品種已有40 多個[6]。近年來，隨著研究的不斷深入，水稻花藥培養技術也在逐步完善，并與其他技術相結合應用在遺傳育種上，已經成為生物技術育種中相對成熟、實用而有效的技術[2]。

2 影響水稻花藥培養效率的技術要點

在實際操作過程中，由于受基因型、培養基組成以及培養環境的影響，水稻花藥培養仍然比較困難，尤其是秈稻花藥培養力過低，獲得的再生植株群體較小，育種選擇受到較大的限制，對后續研究產生很大影響。因此，提高花藥培養效率，適當擴大花藥培養后代群體，對水稻花藥培養育種成敗至關重要[7]。提高水稻花培效率，有必要處理好整個過程的每一個環節，完善和優化水稻花藥培養技術體系。

2.1 基因型選擇基因型對水稻花藥培養力的影響最大。一般認為，花藥培養力的大小為糯稻>粳稻>粳秈雜交稻>秈型雜交稻>秈稻，但同一類型的不同品種之間也存在較大差異[8]。秈稻花藥培養力一般偏低，平均愈傷誘導率只有0.5%，一般不會超過5%，有些材料甚至不能誘導出愈傷組織或者難以得到再生植株[9]；綠苗分化率僅有0.1%～1.0%，平均0.5%[2]。與秈稻相比，粳稻類型更容易被誘導，愈傷誘導率可以達到40%，一般也會超過10%[10]。苗立新等[11-12]的研究表明，不同水稻材料之間的花藥培養效率存在明顯差異，F1的花培效率通常會介于雙親之間而偏向母本。如果雙親的花培效率高，則F1的效率也會較高。通常，如果親本材料有花培效率高的粳稻血緣，F1的花培效率也會較高。因此，可以通過篩選基因型，積累花培效率較高的水稻材料，用粳稻品種作為橋梁親本，配制優異的雜交組合來獲取較大量的花培后代群體。

2.2 取材與低溫預處理研究普遍表明，水稻花藥培養的最佳時期是單核靠邊期，過早或過晚取穗都會影響愈傷誘導率[13]。田間取材的最佳時間一般為晴天的8：00-10：00 或16：00-18：00，此時花粉發育正處于分裂盛期[14]。田間取穗時可通過某些器官的形態指標來判斷花藥的發育時期。通常，幼穗苞大而不破，劍葉與倒二葉的葉枕距為8～13cm，多數穎殼已接近成熟大小呈現黃綠色，花絲長度為穎殼的1/3～1/2。但在不同類型的水稻材料中，這種形態指標會有所變化。因此，在實際操作過程中，應首先參考植株的形態指標，然后通過鏡檢結果來確定花粉發育的確切時期，以大部分花粉處于單核靠邊期為宜。

取材后的低溫預處理可以明顯提高水稻花藥培養的愈傷誘導率。低溫處理的作用機制是延緩花粉的退化、維持花粉發育的生理環境、提高內源性生長素水平并降低乙烯水平、啟動雄核發育等[3]。方法是將幼穗的葉片剪去大部分留葉鞘，用75%的酒精棉球擦拭表面進行消毒，然后用干凈的濕紗布包裹放入保鮮袋中，置于冰箱中冷藏。以往的研究表明，一般低溫8～10℃，預處理7～10d，培養效果比較好，最長不超過20d[4]。另外，不同材料低溫處理的最適溫度和最適時間也會略有不同[9]。

2.3 培養基配制培養基分為誘導愈傷培養基和愈傷分化培養基，這兩種培養基的組成及配比十分重要，直接影響花藥培養力。培養基中基本培養基、激素、碳源和有機附加物等各種組分相互作用相互影響，目前，還很難找到一種可以適用于各種類型水稻材料的萬能培養基。

2.3.1 基本培養基水稻花藥培養中應用的基本培養基種類很多，如N6、馬鈴薯培養基、合5、SK3、通用、M8 和改良M8 等。用不同的培養基培養同一材料，會表現出不同的花培效果。通過大量實驗及比較分析，在誘導愈傷階段，N6 培養基適用于粳稻[15]、合5 適用于秈稻[16]、SK3 適用于秈粳雜交[17]、通用和M8 對秈稻和粳稻均較適用[18]；在愈傷分化階段，不論秈稻或粳稻，MS 培養基均比較適用。在實際應用中，應該根據不同類型的水稻材料，適當調整培養基的各種組分及配比，以獲得最佳培養效果。

2.3.2 激素配比培養基中外源激素的種類及比例在水稻花藥培養過程中起著至關重要的作用，合理調節KT、2，4-D、NAA 和6-BA 等激素的用量和比例可以提高水稻花藥培養的效率。通常，在誘導愈傷階段以生長素類為主，一般用2，4-D、NAA等，其中2，4-D 是誘導愈傷組織最有效的物質；愈傷分化階段以細胞分裂素類為主，一般用6-BA、KT 等。研究表明，使用復合激素較使用單一激素效果更好，不同材料的最適激素種類及比例有很大差異[4]。郭書巧等[19]以3 個秈粳雜交組合F1和粳稻品種武運粳8 號為試驗材料，結果表明2.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L NAA+0.2mg/L KT 為最佳的激素誘導配比，2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L KT 具有更好的分化效果。向發云等[20]以5 個秈稻雜交組合F1的花藥為材料，發現2.0mg/L 2，4-D+3.0mg/L NAA+1.0mg/L KT 誘導愈傷效果較好，2.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA 分化效果較好。張艷敏等[21]以3 個粳稻品種為材料，研究表明誘導愈傷組織的最佳組合為2.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L NAA+1.0mg/L KT。

2.3.3 碳源早期研究人員通常用蔗糖作為水稻花藥培養的標準碳源，適宜濃度為3%～6%[4]。隨后研究表明，在水稻尤其是秈稻的花藥培養中，麥芽糖作為碳源誘導愈傷效果要優于蔗糖，并且誘導出的愈傷組織具有更好的分化效果[13，22]。朱永生等[23]的研究也得出相似結論，并證明混合使用蔗糖和麥芽糖（3%蔗糖+3%麥芽糖）有更好的花培效果。使用混合碳源比使用單一碳源的效果要好，原因可能是混合碳源在誘導愈傷過程中滿足了不同發育階段糖類代謝的不同需求[9]。

2.3.4 其他成分培養基中其他成分的添加也會影響愈傷誘導及分化。研究表明，在培養基中添加天然活性物質如馬鈴薯提取液、椰子汁、玉米汁、絲瓜傷流液等和有機添加物如山梨醇、水解酪蛋白、酵母汁、脯氨酸等，對提高秈稻綠苗產出率有較為明顯的效果[24]。活性炭是常用的添加劑，丁元豐等[25]研究表明活性炭可以顯著增加水稻組合的苗高、根長、根數和鮮重，有利于花培苗的生長與分化。在秈稻誘導愈傷階段是否添加脯氨酸存在爭議，大多數人認為添加適當濃度的脯氨酸后，可以提高秈稻的愈傷組織誘導率[26]。

2.4 接種與培養用75%的酒精將稻穗表面消毒，然后剝除苞葉，將合適的帶枝小穗在新配制的10%次氯酸鈉溶液中浸泡10～20min，期間不時振蕩攪拌，然后用無菌水沖洗4～5 次，用無菌濾紙吸干水后，用“剪穎抖藥法”在無菌條件下把花藥接種到誘導愈傷培養基上，每皿接種200～300 枚花藥。在26～28℃的黑暗條件下培養，接種30～60d 內統計愈傷組織塊數。

將已長出的2～3mm、淡黃緊湊的新鮮愈傷轉移至分化培養基中進行光照培養，光培養的光照強度為1000～l500Lx，光照時間為10～12h/d，室溫保持在26～28℃，分化培養45d 內統計綠苗叢數和白苗叢數。計算愈傷誘導率、綠苗分化率、白苗分化率、分化率以及綠苗產率，以確定培養材料花藥培養力的大小。計算公式如下。

2.5 壯苗與煉苗當幼苗長至2～3cm 高時，將其轉移至生根培養基中壯苗。培養約7d 后幼苗根長達1.5～2.5cm，打開瓶蓋煉苗3d，然后清洗根部培養基，將較老葉、黃根剪去，用清水繼續養苗3～5d 后，移栽到大田進行常規管理。

3 水稻花藥培養存在的問題

水稻花藥培養是以系統選育與雜交育種為基礎，利用植物組織培養技術發展起來的一項育種新技術。與分子標記輔助選擇、轉基因等其他分子生物學技術相結合，可以培育出優質、高產、多抗、廣適的優良新品種，但目前影響水稻花培效率的遺傳機理尚不清楚，在實踐中仍然存在許多技術困難。

水稻花藥培養整個過程步驟繁瑣、周期長、工作量大，并且綠苗產率不高，尤其是秈稻更低，有些材料甚至不能誘導出愈傷組織或者難以得到再生植株，從而阻礙了花藥培養技術在秈稻育種上的應用。一般認為，綠苗產率受基因型影響最大。目前，常用的方法是從綜合性狀優良的水稻材料中，篩選出綠苗產率高的材料，再配制優異的雜交組合進行培養來獲取較大量的花培后代群體。

在花藥培養過程中，由于取材時期、培養基組分和培養條件等因素的影響，往往會存在花藥褐化和白化苗的問題。在誘導愈傷早期花藥常常會褐化，小孢子由于得不到充足的營養而退化，從而影響愈傷組織的誘導形成。為減少褐化，除了取材時要選擇大部分花藥處于單核靠邊期的幼穗外，還應注意適宜的光照強度、光照時間和培養溫度。在綠苗分化階段，通常還會產生大量的白化苗。已有不少報道表明，花藥的生長狀態和培養條件均可以影響白化苗分化率。在誘導培養基中，適當降低培養基中無機鹽濃度和錳的含量，適量調整2，4-D 或者KT的激素配比[27]，既能提高愈傷誘導率，同時又能降低白苗分化率。在愈傷誘導和分化階段，在不影響正常生長和分化的前提下降低溫度，減少光照也可以降低白苗分化率。

4 水稻花藥培養的展望

目前，大部分水稻的綠苗產率仍然很低，尤其是秈稻，遠遠不能滿足育種需要。提高水稻花藥培養效率，不僅要選擇綜合性狀優良、花藥培養力高的水稻材料，還要完善和優化水稻花藥培養技術體系。供體材料確定后，應在田間取材的最佳時間選取大部分花粉處于單核靠邊期的幼穗，為后期的花培過程奠定良好的基礎。在低溫預處理過程中，一般情況下8～10℃低溫預處理7～10d。誘導愈傷和綠苗分化階段，除了根據不同類型的水稻材料選擇合適的基本培養基、最適激素種類及配比、復合碳源和其他成分外，還應注意合適的光溫條件，這對花藥培養效率有明顯的影響。總之，不同材料的適宜培養條件各不相同，所以要在實際工作中不斷摸索，尋找某種或某類材料的最佳培養條件。此外，在獲得幼苗后，注意移栽前要煉苗，移栽后加強田間管理，以提高成苗率。

基于目前水稻花藥培養的研究現狀和存在問題，在今后的工作中，應該完善和優化水稻花藥培養技術體系，在保證花培效率的同時，盡量使花藥培養流程標準化、簡單化、快速化。此外，還要拓寬水稻花藥培養技術在水稻育種工作中的應用，它不僅可以快速純合有益基因，應用于傳統育種工作中，而且可以與分子標記輔助選擇、基因工程等其他分子生物學技術相結合，加速優良新品種的選育與應用。