拮抗茶炭疽病菌的木霉菌發酵培養基響應面優化

周羅娜 趙興麗 周玉鋒 劉輝 羅林麗 賀圣凌 陳銀翠

摘 要：為優化對茶炭疽病菌有拮抗作用的木霉菌發酵培養基，以木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為優化指標，在單因素實驗的基礎上，進行響應面優化，建立了發酵培養基優化模型，獲得了最優發酵培養基配比如下：葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L。在此條件下，木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，比未優化前的菌落直徑縮小了13%。

關鍵詞：木霉菌;發酵液;茶炭疽菌;響應面法

中圖分類號 S476.8;TQ920.1文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）18-0096-06

Optimization of the Fermentation Medium of Trichoderma Antagonistic to Colletotrichum Gloeosporioides

ZHOU Luona1 et al.

（1Institute of Biological Technology，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China）

Abstract：In order to optimize the fermentation medium of Trichoderma.which had antagonistic effect on tea anthrax，the optimal model of fermentation medium was established by using the colony diameter of Trichoderma. treated with fermentation broth.The optimum ratio of fermentation medium was glucose 18.34g/L、yeast extract 1.88g/L、potassium hydrogen phosphate 0.86g/L、ferrous sulfate 0.63g/L.At this condition，the diameter of Colletotrichum gloeosporioides colony was 3.01cm，which was 13% smaller than that before optimization.

Key words：Trichoderma;Fermentation broth;Colletotrichum gloeosporioides;Response surface method

茶炭疽病是一種由真菌引起的、茶樹上常見的葉部病害[1]，在我國各個茶區均有發生，通常在貴州、浙江、福建等雨水多、濕度大的省份發生較多[2-4]。該病主要由炭疽菌（Collectotrichums spp）引起，病菌多從嫩葉侵入，在茶樹成葉上發病，使得葉片焦枯、掉落，影響茶樹光合作用[5]，導致茶葉減產。目前防治炭疽病主要是利用抗病品種，但當病害發生嚴重時，仍采用傳統的化學農藥防治方法為主[6]。然而，農藥殘留不僅對茶葉品質造成嚴重影響，而且還會導致生態系統惡化等嚴重問題。因此，研究開發和使用無毒、無污染、環境相容性好的生物農藥是大勢所趨，生物防治是實現農業可持續發展的重要途徑。

木霉菌（Trichoderma spp）作為生防菌劑是近年來研究開發的熱點。木霉菌屬于半知菌亞門、絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科的真菌，廣泛存在于土壤、空氣和植物體表面等生態環境中。目前，通過大量研究已經成功鑒定得到了21個種類[7-8]。國內外許多學者將木霉菌制劑用于防治植物病害，如紋枯病（Rhizoctonia solani）[9-11]、稻瘟病（Pyricularia grisea）[12-13]、水稻惡苗病（Fusarium moniliforme）[14-15]，并取得了較好的效果。筆者對1株具有拮抗茶炭疽病菌作用的木霉菌進行液體發酵培養基優化，以盡可能提高木霉菌發酵液中抑制茶炭疽病菌生長的物質含量，在一定程度上節約成本，提高發酵效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 木霉菌（Trichoderma asperelloides）、茶炭疽病菌（Collectotrichum boninense）均由本實驗室分離保存。

1.1.2 儀器與設備 GI100DP滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）;BSD-YX3400恒溫搖床（上海博訊醫療生物儀器有限公司）;SPX-250BⅢ生化培養箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;SW-CJ-2D型凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;艾柯DZG-303A超純水制備儀;BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）。

1.1.3 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。PDB培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 木霉菌菌種培養 平板活化：在PDA培養基上接種直徑5mm木霉菌菌餅，28 ℃ 恒溫培養，培養7d。種子液培養：在500mL錐形瓶中裝100mL PDB培養基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養溫度28℃，搖床轉速 120r/min，培養 3d后進行接種發酵。

1.2.2 茶炭疽菌菌種培養 平板活化：在PDA培養基上接種直徑5mm茶炭疽病菌菌餅，25℃黑暗培養5d。

1.2.3 單因素試驗（1）木霉菌發酵液碳源的篩選及濃度確定。不同碳源對木霉菌菌絲生長和產孢的影響：基本培養基為PDA培養基，分別添加20g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖替代PDA培養基中的碳源，并設置無糖作為對照。在制備好的平板中央接種直徑5mm木霉菌菌餅（每組實驗設3次生物學重復）28℃恒溫培養。48h后采用“十”字交叉法測量菌落生長直徑作為菌絲生長狀況指標，培養7d后用10mL滅菌ddH2O洗脫菌落孢子制成孢子懸浮液，用血球計數板計數孢子產量，公式如下：

1mL孢子懸浮中的總孢子數=A/5×25×104×B （1）

式中，A：5個中格的總孢子數;B：稀釋倍數。

木霉菌發酵液最佳碳源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：基本發酵培養基為PDB培養基，最佳碳源添加量分別為0、5、10、15、20、25、30、35g/L，配置完成的培養基115℃滅菌30min。在500mL錐形瓶中裝100mL發酵培養基，向培養基中接種2mL種子液，培養溫度28℃，搖床轉速120r/min，培養5d。

將上述發酵液經抽濾、微濾后取濾液。將濾液與滅菌好的PDA培養基1∶9混合均勻，不添加濾液的PDA培養基作為對照實驗。在平板中央接種直徑5mm茶炭疽菌菌餅（每組實驗設3次生物學重復），25℃黑暗培養5d。采用“十”字交叉法測量并記錄茶炭疽病菌菌落生長直徑。

（2）木霉菌發酵液氮源的篩選及濃度確定。不同氮源對木霉菌菌絲生長和產孢的影響：在基本培養基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分別添加硝酸鈉，蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、丙氨酸、尿素、硫酸銨，設無氮源為對照，添加量為2g/L，方法同上。木霉菌發酵液最佳氮源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發酵培養基中添加最佳碳源添加量，最佳氮源添加量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L，方法同上。

（3）木霉菌發酵液磷源的篩選及濃度確定。不同磷源對木霉菌菌絲生長和產孢的影響：在基本培養基PDA中采用最佳碳源添加及其最佳添加量，分別添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，設置無磷源為對照，添加量為1g/L，方法同上。木霉菌發酵液最佳磷源添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發酵培養基中添加最佳碳源添加量，最佳磷源添加量分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4g/L，方法同上。

（4）木霉菌發酵液微量元素的篩選及濃度確定。不同微量元素對菌絲生長和產孢的影響：在基本培養基PDA中采用最佳碳源及其最佳添加量，分別添加硫酸鈉、硫酸亞鐵、硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸錳，并設無微量元素作對照，添加量為0.5g/L，方法同上。木霉菌發酵液最佳微量元素添加量對茶炭疽病菌菌落生長的影響：在基本發酵培養基中添加最佳碳源添加量，最佳微量元素添加量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L，方法同上。

1.2.4 響應面優化試驗 根據單因素試驗結果和Box-Behnken試驗設計原理，以最佳碳源、氮源、磷源、微量元素添加量為響應面考察因素，每個因素設計3個水平，用（-1，0，1）作為編碼，以木霉菌發酵液處理后的茶炭疽病菌菌落生長直徑作為響應值（Y），使用Design-Expert 10軟件進行4因素3水平試驗優化，每個處理3次重復。培養基因素水平如表1所示。

2 結果與分析

2.1 木霉菌發酵液的碳源及濃度 碳源為菌體的生長代謝提供細胞的基本骨架，也是細胞生命活動的能量來源，會影響次級代謝產物的產量。由圖1可知，5種碳源中，添加葡萄糖，木霉菌菌絲生長較快，產孢量較多。

由圖2可知，選擇葡萄糖為最佳碳源，隨著木霉菌發酵液葡萄糖添加量的增大，發酵液抑制茶炭疽菌菌落的直徑先減小后增大。葡萄糖添加量為20g/L時，經木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，僅為4.11cm，抑菌效果最好。后續單因素試驗中，選擇葡萄糖添加量為20g/L。

2.2 木霉菌發酵液的氮源及濃度 菌體的生長和各種初級、次級代謝產物等含氮物質的合成都需要氮源，氮源在發酵過程中還起著調節菌體生長及生物量的作用。由圖3可知，木霉菌對有機氮源利用效果比無機氮源好，其中酵母浸膏效果最好。

在選擇酵母浸膏為最佳氮源的條件下，在木霉菌發酵培養基中加入不同濃度的酵母浸膏進行發酵，結果如圖4所示。由圖4可知，木霉菌發酵液的抑菌活性在酵母浸膏濃度為1.5g/L時最強，抑菌效果最好，經木霉菌發酵液處理后的茶炭疽病菌菌落直徑為3.89cm，之后隨著酵母浸膏濃度的進一步增加，抑菌效果反而降低。因此，選擇最佳酵母浸膏濃度為1.5g/L。

2.3 木霉菌發酵液的磷源及濃度 磷主要作用是維持菌體細胞結構的穩定性。由圖5可知，添加磷酸氫二鉀對木霉菌菌絲生長和產孢有促進作用，添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀對菌絲生長及產孢略有抑制作用。

由圖6可知，選擇磷酸氫二鉀為最佳發酵磷源，木霉菌發酵液的抑菌活性在磷酸氫二鉀濃度為1g/L時最高，經木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，僅為4.02cm，抑菌效果最好。因此，選擇最佳磷酸氫二鉀濃度為1g/L。

2.4 木霉菌發酵液的微量元素及濃度 菌體的生長和發酵產物的形成需要一些微量元素作為酶的輔基或激活劑。由圖7可知，微量元素的添加對木霉菌菌絲生長及產孢影響不大，其中，添加硫酸亞鐵對菌絲生長和產孢略有促進作用，而添加硫酸鋅、硫酸錳、硫酸鈣、硫酸銅、硫酸鈉、硫酸鎂略有抑制作用。

由圖8可知，選擇硫酸亞鐵為最佳發酵微量元素，木霉菌發酵液的抑菌活性在硫酸亞鐵濃度為0.6g/L時最高，經木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑最小，為3.52cm，抑菌效果最好，因此選擇最佳硫酸亞鐵濃度為0.6g/L。

2.5 響應面優化試驗

2.5.1 響應面試驗結果 根據單因素試驗結果和Box-Behnken試驗設計原理，選擇葡萄糖、酵母浸膏、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵作為自變量，以經木霉菌發酵液處理后茶炭疽病菌菌落生長直徑作為響應值，進行4因素3水平響應面優化試驗。試驗設計方案及結果如表2所示。

2.5.2 模型及顯著性 根據表2的實驗結果，運用Design expert 10.0軟件對結果進行回歸擬合，得到如下回歸方程：

Y=3.37+0.85A-0.42B+0.087C+0.29D-0.058AB-0.087AC-0.29AD+1.15BC-0.43BD+0.79CD+0.98A2+1.01B2+0.64C2+0.32D2

由表3可知，該模型P<0.0001，說明模型是極顯著的;模型相關系數R2=0.9508，表明模型擬合較好;模型失擬項的P值為0.7556，差異不顯著，表明該模型符合實際情況。試驗結果表明，4個因素對木霉菌發酵液抑菌效果的影響大小依次為：葡萄糖>酵母浸膏>硫酸亞鐵>磷酸氫二鉀。由回歸方程系數顯著性檢驗可知：A、B、BC、CD、A2、B2、C2差異極顯著（P<0.01），D、BD、D2差異顯著（P<0.05），其他不顯著。

2.5.3 木霉菌發酵的最佳培養基 通過Design-expert軟件繪制響應面圖對試驗結果進行可視化分析。從響應面三維圖（圖9）可看出，該方程的拋物線圖形開口均向上，說明方程存在最小值。由軟件分析得到木霉菌發酵培養基中添加葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L時，木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為2.98cm。

為驗證響應面法所得結果的可靠性，按照響應面確定的各因素最優濃度配制木霉菌發酵培養基進行3次試實驗驗證。在試驗條件下，木霉菌發酵液處理后的茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，與預測值接近，說明響應面可運用于實際預測。

3 結論與討論

以木霉菌為研究對象，對其發酵液抑制茶炭疽菌的活性進行研究，并利用響應面優化其液體發酵培養基。結果表明：木霉菌液體發酵培養基的最優配比為葡萄糖18.34g/L、酵母浸膏1.88g/L、磷酸氫二鉀0.86g/L、硫酸亞鐵0.63g/L;在此條件下，木霉菌發酵液處理后茶炭疽菌菌落直徑為3.01cm，與未優化的發酵培養基處理后的茶炭疽菌菌落直徑（約為3.46cm）相比，茶炭疽菌菌落直徑縮小了13%。后續將對發酵液中的小分子物質、脂溶性物質、水溶性物質分離、純化后進行下一步的研究，以期得到更穩定、高效的木霉菌抑制茶炭疽菌制劑。

參考文獻

[1]唐美君.茶炭疽病的識別與防治[J].中國茶葉，2019，41（4）：6-8.

[2]施利，江建，王勇，等.貴州茶樹病蟲害防控現狀及對策建議[J].茶葉，2015，041（3）：146-149，153.

[3]唐美君，郭華偉，姚惠明，等.龍井茶區茶炭疽病的發生規律[J].浙江農業科學，2019，60（10）：1763-1765.

[4]鐘靈珅.茶葉炭疽病病原菌的分離鑒定及防控技術[D].福州：福建農林大學，2018，.

[5]唐美君，肖強.茶樹病蟲及天敵圖譜[M].北京：中國農業出版社，2018.

[6]裴朝鑒.茶樹炭疽病的發生原因及防治措施[J].福建農業科技，2012（2）：34-35.

[7]Pan Z Y，Fu J F，Ma L，et al. Diversity of Trichoderma spp. isolated from medicinal plant rhizosphere soils in Liaoning Province[J]. Journal of Zhejiang University，2010，36（4）：405-410.

[8]Saravanakumar K，Yu C，Dou K，et al. Biodiversity of Trichoderma Community in the Tidal Flats and Wetland of Southeastern China[J]. Plos One，2016，11（12）.

[9]史鳳玉，朱英波，楊文蘭.長枝木霉T8對水稻紋枯病菌拮抗的作用研究[J]. 中國農學通報，2005，21（2）：264-265.

[10]Kotasthane A，Agrawal T，Kushwah R，et al. In-vitro antagonism of Trichoderma spp. against Sclerotium rolfsii，and Rhizoctonia solani，and their response towards growth of cucumber，bottle gourd and bitter gourd[J]. European Journal of Plant Pathology，2015，141（3）：523-543.

[11]Sivaraju K，Rao C C，Raju C A. Antagonistic Potential and Molecular Characterization of Trichoderma Harzianum Isolates against Sclerotium Rolfsii Infecting Tobacco[J]. Journal of Biological Control，2009，23（2）.

[12]Ali H，Nadarajah K. Evaluating the efficacy of Trichoderma spp and Bacillus substilis as biocontrol agents against Magnaporthe grisea in rice[J]. Australian Journal of Crop Science，2014，8（9）：1324-1335.

[13]Sy A A，Sarr A，Albertini L，et al. Biological control of Pyricularia oryzae：parameters of stability of antagonistic activity[J]. Phytopathologia Mediterranea，1990.

[14]Calistru C，Mclean M，Berjak P. In vitro studies on the potential for biological control of Aspergillus flavus and Fusarium moniliforme by Trichoderma species. 1. Macroscopical and microscopical observations of fungal interactions[J]. Mycopathologia，1997，137（2）：115-121.

[15]Elhasan A，Walker F，Buchenauer H. Trichoderma harzianum and its Metabolite 6-Pentyl-alpha-pyrone Suppress Fusaric Acid Produced by Fusarium moniliforme[J]. Journal of Phytopathology，2008，156（2）：79-87.

（責編：徐世紅）