馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實驗條件優化

黎楚怡，熊新威，杜曉東,2

馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實驗條件優化

黎楚怡1，熊新威1，杜曉東1,2

（1.廣東海洋大學水產學院//2.廣東省珍珠養殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

【】優化馬氏珠母貝（）雙鏈RNA干擾實驗的條件。注射不同次數的干擾探針進行不同時間的干擾，通過實時熒光定量檢測基因的表達；通過掃描電子顯微鏡觀察貝殼珍珠層內表面新生層的生長并分析不同組別貝殼的生長情況。注射60 μg探針1次時，實驗組基因在外套膜套膜區相對表達量顯著低于對照組，且實驗組基因6 d的相對表達量顯著低于4 d；注射60 μg探針2次時，8 d基因在外套膜套膜區的相對表達量顯著低于對照組。掃描電子顯微鏡觀察結果表明，所有實驗組貝殼珍珠層均出現無序生長；與實驗組4 d和8 d相比，6 d時新生珍珠層新生層邊界完全被破壞，并且出現更多散亂的細小晶體。注射60 μg雙鏈RNA探針1次并在6 d后收集樣品，為馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實驗探究基因功能的穩定高效條件。

馬氏珠母貝；雙鏈RNA干擾；優化

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指一種分子生物學上由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在轉錄水平誘發的基因沉默現象[1]。RNA干擾的作用機理：（1）起始階段：外源dsRNA被Dicer酶切割成大小約21 ~ 23 bp的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）；（2）效應階段：siRNA雙鏈結合核酶復合物，形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC中siRNA變性解開雙鏈，反義鏈結合在復合物上，并引導RISC與同源的靶mRNA結合，在核酸內切酶的作用下，自siRNA中點位置處將靶mRNA切斷，阻斷其翻譯成蛋白質[2-3]；（3）擴增階段：以siRNA中的一條鏈為引物、靶mRNA為模板，在RNA介導的RNA聚合酶作用下，擴增靶mRNA，產生新的siRNA反作用于靶mRNA，使其降解[3]。

昆蟲進行RNAi多數采用顯微注射dsRNA、飼喂法。飼喂法主要通過將dsRNA導入細菌或混入食物、能表達dsRNA的轉基因植物喂養昆蟲[4-5]；在抗病毒感染方面主要是針對病毒的保守序列、宿主細胞表面受體基因合成siRNA及構建表達載體，通過脂質體轉染、顯微注射及其構建逆轉錄病毒載體或腺病毒載體進入小鼠體內抑制病毒[6-7]；在植物基因功能研究中通常構建含發卡結構的雙鏈RNA（hairpin RNA，hpRNA）T-DNA質粒或含內含子的ihpRNA（intron-containing hairpin RNA），利用基因槍整合至細胞、農桿菌介導dsRNA轉化整合至染色體[8-9]；甲殼動物RNAi一般體外轉錄和載體構建合成dsRNA或siRNA并將其注射到血淋巴、肌肉或卵粒中，或將動物組織與雙鏈RNA進行離體培養[10]。基因槍法只能使植物基因產生瞬時沉默效應，而農桿菌介導體內表達dsRNA可獲得長效并穩定遺傳的基因沉默效應[8]；飼喂法因dsRNA或siRNA容易被降解，沉默效果較差，但不會對實驗對象造成損傷，適用于動物體；注射法需要實驗對象進行血液循環，使dsRNA或siRNA迅速到達靶組織，但是操作要求高，操作參數需要優化，體型小的昆蟲等容易被注射操作的機械損傷而導致死亡[5]。雙殼類軟體動物的體型相對昆蟲來說較大，雙殼類軟體動物具有開管式血液循環系統，血液可以浸入各個組織器官與其進行物質交換，雙鏈RNA干擾探針通過注射法進入體內，可快速達到靶組織、靶器官對靶基因進行干擾。

Pif是馬氏珠母貝中研究較為透徹的一個基質蛋白，RMKR是翻譯加工中經常觀察到的一個Kex2-like蛋白酶裂解位點，前體蛋白pif 177通過修飾切割形成Pif 80、Pif 97[11-12]。Pif 80、Pif 97分別位于Pif蛋白的C、N末端[13]，多肽Pif 80-11促進文石在β-幾丁質基質上成核[11]；Pif 97蛋白具有VWFA（Von Willebrand factor type A domain）和CHIT_BIND_II（Chitin-binding type-2 domain），能結合幾丁質框架并促使片層結構的形成[14]。鄭哲[15]研究結果顯示let-7e、miR-2305 的過表達能使基因表達的顯著性下調，導致實驗貝珍珠層結晶出現紊亂；董冰冰等[16]研究結果表明基因表達量呈現隨pH降低而降低的變化趨勢，海水酸化影響鈣沉積，引起珍珠層形貌特征的變化。Suzuki M等[11]通過注射dsRNA干擾，其表達水平顯著降低并觀察到珍珠層無序生長。作為典型的礦化基因，其表達量高低已被用于評估珍珠貝在胚胎發育，殼損傷修復等過程是否發生了礦化的參考。

馬氏珠母貝（），隸屬于軟體動物門，雙殼綱，珍珠貝目，珍珠貝科，珠母貝屬[17]，是我國人工培育海水珍珠的主要經濟貝類之一。貝殼是典型的生物礦化材料[15]，RNA干擾技術是探究基質蛋白礦化功能的重要技術。然而在雙殼貝類，已有研究表明，通過RNA干擾探究基因功能的方法參差不齊，還沒有專門針對雙鏈RNA干擾條件的研究可供參考。本研究選用馬氏珠母貝典型礦化基因作為干擾對象，在實驗室前期較成熟的RNA干擾條件下，比較3種不同干擾條件的干擾效果，明確馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾的最佳條件，優化縮短RNA干擾的實驗周期和RNA干擾探針用量，為后期馬氏珠母貝基因功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 本實驗對象為1.5齡馬氏珠母貝，殼長5 ~ 6 cm。材料來源于廣東省湛江市雷州市覃斗鎮后洪村。

1.1.2 實驗試劑 Reverse Transcriptase M-MLV、Recombinant RNase Inhibitor (40 U/μL)、5XM-MLV Buffer、pMDTM 18-T Vector Cloning Kit、Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0)購自大連寶生物公司，SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit購自Clontech Corporation，Trizol、SYBR? Select Master Mix購自Life Technologies Corporation，GeneJET Gel Extraction Kit購自Thermo Scientific、

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據已獲得序列全長，利用Primer Premier 5 引物設計軟件設計引物（實驗所需用到的引物詳見表1）。分別在上、下游引物的5′端加上T7RNA聚合酶的啟動子序列（表1下劃線部分，序列為GCGTAATACGACTCACTATAGGG），隨后由上海生工公司合成引物。

表1 本實驗所用引物及其序列

1.2.2 mRNA的提取及cDNA第一鏈的合成 運用Trizol法提取外套膜組織的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性，Nano Drop 2000核酸定量儀測定RNA濃度及純度。參照Reverse Transcriptase M-MLV說明書，操作合成cDNA第一鏈。

1.2.3 探針制備 采用多聚酶鏈式反應擴增對中間片段進行擴增。先通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，后根據純化回收試劑盒說明書純化目的基因；回收目的基因片段導入到pMD-18T載體中，再轉化到DH5α感受態細胞中，挑取陽性單克隆菌落進行菌落PCR檢測，對目的菌進行保種并送至生工生物工程（上海）股份有限公司分部廣州測序部測序。對測序結果正確的目的菌進行質粒提取作為體外轉錄合成探針的模板。按照Thermo Scientific體外轉錄說明書進行探針的合成，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的完整性（圖1），用核酸定量儀檢測dsRNA的濃度和純度；用DEPC水將dsRNA的濃度稀釋為600 ng/μL，-80 ℃保存備用。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA-Pif和dsRNA-RFP

1.2.4 RNA干擾 RNA干擾實驗方法參照鄭哲[15]、董冰冰等[18]文獻提到方法的基礎上進行修改。挑選規格一致健康的30只馬氏珠母貝，隨機分成3組，1組實驗組（注射dsRNA-）；一組陰性對照組（注射dsRNA－RFP）和一組空白對照組（注射DEPC水），每組10只，每只注射探針濃度為600 ng/μL，劑量為100 μL。實驗統一使用工業生產使用的排貝法并采用微量注射器往閉殼肌中注射探針。

每組按照以下實驗設計處理：

（1）注射一次探針，在4 d和6 d時分別將實驗組和對照組8只馬氏珠母貝迅速分離馬氏珠母貝的外套膜區，將其放入液氮罐中速凍保存，并將對應的貝殼做好標記，置于封口袋中保存。

（2）以4 d為周期單獨注射共2次，在8 d時分別將實驗組和對照組8只馬氏珠母貝迅速分離馬氏珠母貝的外套膜區，將其放入液氮罐中速凍保存，并將對應貝殼做好標記，置于封口袋中保存。

實驗收集的所有組織樣品按照1.2.2的方法進行總RNA的提取及反轉錄成cDNA模板第一鏈，再利用實時熒光定量PCR技術檢測基因的相對表達量，方法見1.2.5。挑取基因相對表達量出現下調的貝體貝殼，使用切割機將貝殼珍珠層和棱柱層交界部分以1 cm×1 cm的規格切塊，隨后用去離子水溫和地沖洗干凈，置于陰涼通風處晾干，經離子濺射儀濺射3 min，用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope）觀察貝殼內表面珍珠層結晶形貌的超微結構。

1.2.5 實時熒光定量PCR 以反轉錄得到的cDNA第一鏈作為模板，馬氏珠母貝的β-actin基因作為實時熒光定量的內參基因，每個樣品進行3個平行復孔的重復。采用2–ΔΔCT法對實時熒光定量PCR的數據進行處理，利用SPSS 19.0軟件單因素方差分析對目的基因的表達量進行顯著性差異分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 RNA干擾后熒光定量

實時熒光定量PCR技術檢測馬氏珠母貝基因在外套膜區的相對表達量。注射一次探針后，實驗組在4 d和6 d時基因的相對表達量較對照組出現顯著性降低，且6 d時基因的相對表達量顯著低于4 d（圖2 A，表2）。以4 d為注射周期，注射2次探針后，在8 d時實驗組基因的相對表達量顯著低于對照組（圖2 B，表2）。實驗中，陰性對照組和空白對照組基因相對表達量均無顯著性差異。

表2 單因素方差分析參數

標注不同字母表示組內存在差異顯著（< 0.05），標注*和**表示組間存在差異顯著（< 0.05）

Mean values with different letters are significant different in the group(<0.05)； the labels * and ** are significant difference between the groups (<0.05)

圖2 RNA干擾后4 d、6 d和8 d基因的相對表達量

Fig. 2 The relative expression ofgenes in 4 , 6 and 8 days after RNA interference

2.2 RNA干擾后貝殼的超微結構

通過掃描電子顯微鏡觀察貝殼內層新生層，空白對照（DEPC組）和陰性對照組（RFP組）馬氏珠母貝珍珠層結晶形態為清晰的橢圓型或多邊形，界限清晰明顯，各板塊結晶排列緊密，結晶體和結晶層排列規則且表面光滑平整（圖3_1，圖3_2，圖3_5，圖3_6，圖3_9，圖3_10）。是參與珍珠層形成的基因，可控制文石在多糖基質的成核并形成多邊形片結構[13, 19]，經過注射dsRNA－探針進行干擾后珍珠層生長會出現紊亂。不規則、晶體的晶型基本被破壞（圖3_7）且在3 000倍下可明顯看見邊界處出現很多不規則細小晶體（圖3_8），干擾效果最為顯著；4 d的珍珠層出現紊亂生長現象（圖3_3），晶體晶型無序生長，排列不規則，3 000倍下邊界沒有細小晶體（圖3_4），干擾效果較好；以4 d為注射周期，注射2次dsRNA－探針干擾后，8 d時貝殼珍珠層內表面形貌結構亦發生了紊亂生長（圖3_11），3 000倍下邊界還能區分部分珍珠質板層邊界且出現少量細小晶體（圖3_12），干擾效果較差。

1、5、9是空白對照組貝殼珍珠層的超微結構，2、6、10是陰性對照組貝殼珍珠層的超微結構，3、7、11是注射dsRNA-Pif后貝殼珍珠層的超微結構；4、8、12分別是對3、7、11珍珠層局部的放大圖

3 討論

雙鏈RNA干擾是通過導入外源雙鏈RNA，形成RISC復合物以切斷體內目標基因mRNA序列，從而降低基因表達水平的一種技術，是研究基因功能的重要技術。目前在雙殼類中主要方法是通過開貝鉗撬開貝殼、注射探針，并于一定時間后進行取樣檢測。文獻檢索顯示[11,20-24]，進行RNA干擾時，在注射的濃度、劑量和干擾持續的時間上存在差異，沒有專門的參考標準。

RNA干擾效果存在劑量效應。Suzuki等[11]采用濃度分別為5、15和30 μg的RNAi探針，結果顯示隨著探針濃度增加，基因表達水平降低；甲干初[20]實驗結果顯示注射40、80 μg RNAi探針基因表達量與對照組相比分別下降60%、65%，通過掃描電子顯微鏡觀察發現注射40 μg的貝殼內表面邊緣發生卷皺、晶體無序堆積，而注射80 μg的貝殼的晶體無序堆積更為明顯；黃榮蓮等[21]采用注射60 μg的RNAi探針，結果顯示實驗組馬氏珠母貝外套膜邊緣區和套膜區的表達量分別下調61.42%和45.15%，顯微結構觀察發現珍珠層、棱柱層晶體生長紊亂、排列混亂。通過對比甲干初、黃榮蓮等貝殼微觀結構發現，隨著RNAi探針濃度增加，貝殼內表面新生層的晶體排列混亂程度、結晶板塊的形態等超微結構加深，而基因表達量均可顯著下調。盡管RNA干擾效果存在劑量效應，但濃度劑量越大，制備雙鏈RNA干擾探針的成本就會越高。本實驗室前期，通過文獻調查，已成功將RNA干擾技術運用于馬氏珠母貝基因功能研究，實驗條件：RNAi探針用量為60 μg，注射2次，2次注射間隔周期為4 d，在距離第一次注射8 d時進行樣品收集[21]。該方法雖然能夠取得較好干擾效果，卻存在實驗周期長，成本較高等缺陷。目前2次注射仍是實驗室前期常用實驗條件，由于RNA干擾效果還存在時間依賴性，為探究在同樣注射劑量條件下，能否在減少注射次數、縮短實驗周期前提下達到同樣實驗效果。本實驗在同樣注射60 μg RNAi干擾探針的情況下，將單次注射并分別在4 d和6 d收集樣品作為實驗組；以2次注射后，距離第一次注射8 d取樣作為陽性對照。

RNA干擾效果的時間依賴性。何國平等[22]實驗結果顯示mRNA和蛋白質表達在12 h時開始略有降低、48 ~ 72 h降低最明顯，而在96 h恢復到正常表達水平；曾永秋等[23]實驗結果顯示在轉染后12 h即對mRNA的表達產生抑制，48 h抑制率最高，72 h后抑制率下降。上述研究表明，RNA干擾效果由時間延長呈現由弱到強、再由強到弱的逐漸消失趨勢[22]。為探究馬氏珠母貝注射探針后的時間依賴性，本次實驗注射了60 μg雙鏈RNA干擾探針1次，檢測了4 d和6 d時的干擾效果。結果顯示，所有實驗組基因的相對表達量均出現顯著下調，貝殼珍珠層均出現紊亂生長。但6 d時，表達量顯著低于4 d且珍珠層新生層的紊亂生長程度也較4 d時明顯。這說明60 μg雙鏈RNA干擾探針的注射劑量已經達到明顯的干擾效果，且6 d時RNA干擾作用仍在持續。本研究還采用本實驗室前期使用方法進行了一組實驗，以比較兩種方法差異。結果表明，注射2次探針時（4 d/次），8 d時基因的相對表達量出現顯著下調，貝殼珍珠層出現紊亂生長。雖然8 d時基因相對表達量低于注射一次探針4 d和6 d，但是從對貝殼珍珠層影響程度來看，8 d的較注射一次探針6 d的弱。吳偉東等[24]實驗結果表明在0.01 ~ 0.08 μmol/L范圍隨著dsRNA-eGFP濃度增加，RNAi效應明顯增強，而增加到0.16 μmol/L并不能進一步增強抑制效應，說明濃度過高會導致干擾效應被減弱，甚至被消除。8 d珍珠層紊亂效果弱于6 d的現象可能是由于兩次注射后，體內探針濃度過高，導致干擾效應被削弱。此外，還有可能是因為基因被長時間沉默，替補基因被激活，以至于導致基因的相對表達量更低下調而沒有造成對應程度的微觀結構變化。本實驗結果表明注射1次探針且干擾6 d后進行取樣時，實驗組貝殼內表面珍珠層晶體明顯出現紊亂且文石板層間出現大量不規則細小晶體，說明注射探針1次、干擾6 d后取樣為最優條件。

綜合分析，本研究認為注射60 μg探針1次，注射后6 d可收集樣本進行檢測。該方法成本低，周期短，效率高，可作為馬氏珠母貝RNA干擾條件的規范標準，為后期馬氏珠母貝基因功能的研究提供參考。

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Optimization of Double-stranded RNA Interference Experiments of

LI Chu-yi1，XIONG Xin-wei1，DU Xiao-dong1,2

（1./2.,524088,）

The conditions of the double-stranded RNA interference experiment ofwere optimized.The pearl oysters were injected by the probe with a different number of times and different interfering times. The expression level ofgene was detected using Real-time fluorescence quantification PCR. The inner surface of shell nacreous layer was observed and the growing situation of a new layer in the different group was analyzed.When 60 μg probes were injected once, the relative expression level ofgene in the experimental group was significantly lower than that in the control group, and relative expression ofgene in the experiment group at the 6th day was significantly lower than that at the 4th day. When 60 μg probes were injected twice, the relative expression level ofgene in the experimental group was significantly lower than that in the control group on 8th day. The result of scanning electron microscopy indicated that all the new growth nacreous layers in the experimental group exhibited the disordered growth; compare with the 4th and 8th days, the ordered boundary on the new nacre was destroyed completely and more small crystal was arranged irregularly.The best stable and efficient conditions of the double-stranded RNA interference ofwere: inject 60 μg double-stranded RNA probes once and collect the sample at 6 days postinjection. These optimized conditions would contribute to the exploration of gene function in.

; double-stranded RNA interference; optimization

S917.4

A

1673-9159（2020）06-0009-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.002

黎楚怡，熊新威，杜曉東. 馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實驗條件優化[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（6）：9-15.

2020-06-20

廣東省自然科學基金項目（2018A030310666, 2019A1515111026,2020A1515010691）；廣東省教育廳項目（2017KCXTD016）

黎楚怡（1997－），女，碩士研究生，研究方向為水產養殖學。Email:1322990177@qq.com

杜曉東，男，教授。E-mail：gdhddxd@hotmail.com

（責任編輯：劉嶺）