代謝工程改造大腸桿菌MG1655積累L-蘋果酸

何 彬，周志東，曹 陽，黃 皓，周 衛，陳 俊

(武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢，430081)

L-蘋果酸是生物體三羧酸(TCA)循環中的一種重要中間產物，廣泛應用于食品、醫藥、化工等多個領域[1]。早期生產蘋果酸的方法主要有化工合成法、植物提取法以及采用琥珀酸為原料的酶轉化法[2]，然而隨著此類方法所需成本日益增加、人們的環保意識不斷增強，節能、環保且高效的微生物發酵技術已成為獲取蘋果酸的重要途徑。作為已知的蘋果酸高效生產菌株，曲霉屬菌種諸如黃曲霉、黑曲霉和米曲霉等均能以葡萄糖為碳源積累蘋果酸，尤其使用黃曲霉獲取L-蘋果酸最大積累量可達100 g/L，但是在其發酵過程中通常伴有曲霉毒素產生，不適合用于大規模工業生產[3-6]，因此，研究者開始嘗試使用其它菌株發酵生產L-蘋果酸，如劉亞等[7]利用米根霉突變菌株，通過初步優化發酵工藝，以葡萄糖為碳源，經72 h發酵，所得L-蘋果酸積累量達到了57.71 g/L。同時，隨著基因工程的發展，通過基因編輯得到基因工程菌發酵生產L-蘋果酸的技術日漸成熟，婁菲等[8]通過敲除大腸桿菌E21中的蘋果酸酶基因maeA和maeB，使得蘋果酸產量提高了36%；陳修來等[9]通過在釀酒酵母中表達來自黃曲霉的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶以及C4-二羧酸轉運蛋白，成功構建了L-蘋果酸的合成路徑，使得工程菌能夠積累L-蘋果酸，為相關合成技術提供了參考；Dong等[10]通過在大腸桿菌w3110中過表達pos5基因，增加了NADPH含量，使得最終的L-蘋果酸產量達到9.34 g/L。雖然可通過在大腸桿菌或釀酒酵母等模式菌中過表達異源的蘋果酸酶基因來提高L-蘋果酸產量[11]，但因為不涉及菌株基因組的改造，其性狀通常難以穩定遺傳。另一方面，基因編輯技術的快速進步也為代謝工程改造菌株提供了動力，如Ⅱ型CRISPR系統最初被發現是細菌和古細菌用來防止外源DNA入侵的一種免疫系統[12-15]，相對于傳統的同源重組技術，Ⅱ型的CRISPR/Cas9基因編輯系統具有效率高、周期短、操作步驟簡單等特點，對單個基因的編輯效率最高可達100%[16]。基于此，本文選取遺傳背景清楚且易于進行分子操作的大腸桿菌MG1655，借助CRISPR/Cas9基因編輯系統對其進行代謝工程改造來積累L-蘋果酸，以期為微生物發酵技術生產L-蘋果酸提供參考。

1 試驗

1.1 材料及基因改造

1.1.1 培養基

LB液體培養基中胰蛋白胨、酵母提取物及氯化鈉的質量濃度分別為10、5、10 g/L，另外，在此基礎上按15 g/L添加瓊脂粉制得LB固體培養基。

M9培養基中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl及葡萄糖的質量濃度分別為6.78、3、0.5、1、20 g/L，且在使用時按1%的體積分數添加適量的MgSO4和CaCl2。

1.1.2 酶和試劑

質粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒為美國OMEGA公司產品；DNA Marker、2×ES Taq MasterMix為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品；蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸等有機酸標準樣品為Sigma-Aldrich公司產品；其它試劑均為國產分析純試劑。

1.1.3 CRISPR/Cas9介導的基因敲除

本研究所用野生型大腸桿菌MG1655和大腸桿菌DH5α均為本實驗室所保存，質粒pTargetF和pCas購于中國科學院上海生命科學研究院，重組質粒和基因敲除菌株均由本實驗室構建?；蚋脑旌蟮拇x途徑如圖1所示，在利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對大腸桿菌MG1655進行基因敲除之前，需進行敲除載體pTargetF-sgRNA的構建及同源臂片段的制備。

圖1 大腸桿菌MG1655部分代謝流程圖

在構建poxB基因敲除載體時，以pTargetF質粒做模板，以poxB-P1和poxB-P2為引物，通過全質粒PCR擴增，得到含有poxB 相關sgRNA的pTargetF，擴增條件為：預變性95 ℃，300 s； 95 ℃，30 s； 58 ℃，30 s；72 ℃，90 s，32個循環； 72 ℃，600 s，4 ℃保存。使用DpnⅠ酶進行消化，消除pTargetF原始模板，轉化大腸桿菌DH5α，提取重組質粒，用引物maeA-P3和maeA-P4借助美國UVP公司GelDoc-It310型凝膠成像儀進行PCR鑒定[13]，所構建的重組質粒命名為pTargetF-poxB。按同樣的方法，分別構建pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB和pfkA基因的敲除載體。

在制備poxB同源臂片段時，以大腸桿菌MG1655基因組為模板，以引物poxB-P5和poxB-P6擴增poxB基因的上游同源臂，以引物poxB-P7和poxB-P8擴增poxB基因的下游同源臂。然后以poxB-P5和poxB-P8為引物，以上、下游同源臂做模板，通過SOE-PCR進行擴增，得到上、下游同源臂的融合片段[15]。按同樣方法，利用不同引物分別制備pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB和pfkA基因上、下游同源臂的融合片段。

在敲除載體構建完畢并制得同源臂片段后，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對大腸桿菌MG1655進行基因敲除。首先敲除其poxB基因，獲得M01菌株，具體敲除步驟如下：1)將pCas質粒轉化至大腸桿菌MG1655中，獲得含有pCas 質粒的大腸桿菌MG1655菌株(卡那霉素抗性)；2)挑取單菌落接種到含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養基中過夜培養，之后以1%的接種量轉接到25 mL卡那霉素質量濃度為50 mg/L的 LB液體培養基中，加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖誘導pCas質粒上red蛋白的表達，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉速振蕩培養至OD600約為0.4左右時，再利用美國貝克曼庫爾特公司J-26XP型高速冷凍離心機冷凍離心回收菌體并制作用于電轉化的感受態細胞；3)利用BIO-RAD公司165-2100型電轉化儀進行電轉化處理。向50 μL感受態細胞中加入100 ng pTargetF-poxB重組質粒和100 ng目的基因同源片段，混勻后加入經預冷處理、直徑為1 mm的電轉杯中，在1.8 kV電壓下進行電轉，然后迅速轉入預冷的1 mL的LB液體培養基中，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉速培養1 h以復蘇細胞；4)最后將菌體接種于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L壯觀霉素的雙抗性LB固體培養基上，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉速培養過夜，獲得M01菌株，回收菌體，使用細菌DNA提取試劑盒提取基因組，利用引物P5/P8進行PCR鑒定[17-18]。按照同樣方法，在M01菌株基礎上繼續敲除pta-ackA、ldhA、pflB等基因，依次獲得M02、M03和M04菌株，阻斷相關副產物的合成以積累丙酮酸，增大TCA循環的通量；然后在M04菌株基礎上繼續敲除maeA和maeB基因以防止蘋果酸的消耗[19]，所得菌株依次為M05和M06；最后再敲除M06菌株的pfkA基因得到M07菌株，確保葡萄糖盡可能通過磷酸戊糖途徑代謝，從而產生更多的輔酶NADPH，為合成蘋果酸提供還原力[20]。本研究中所用重組質粒及所制基因敲除菌株列于表1，所用引物列于表2。需要指出的是，每一次基因敲除成功后所得菌株會同時含有pCas質粒和pTargetF重組質粒，為了消除這兩個質粒，首先將菌株接種至含有50 mg/L卡那霉素和終濃度為1.0 mmol/L IPTG的LB液體培養基中，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉速培養8～16 h，再將其涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養基上，挑取單菌落，檢測其壯觀霉素抗性，如無壯觀霉素抗性，則表明pTargetF重組質粒已消除，繼續挑取該單菌落接種于不含抗性的LB液體培養基中，在37 ℃的溫度下，以200 r/min轉速培養8～16 h后涂布無抗性LB固體培養基，挑取單菌落檢測其卡那霉素抗性，如無卡那霉素抗性，則表明pCas已消除。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

表2 引物Table 2 Primers

續表2

1.2 發酵處理

對野生型大腸桿菌MG1655及M04、M05、M06、M07菌株分別進行有氧搖瓶發酵處理。將-80 ℃保存的菌株在添加相關抗生素的LB平板上劃線，挑取單菌落接種到裝有5 mL液體LB培養基的試管中，在37 ℃溫度下以200 r/min的轉速培養過夜，再以1%的接種量轉接到裝有50 mL液體M9培養基的錐形瓶中，在37 ℃溫度下以200 r/min的轉速發酵處理48 h。

在好氧發酵條件下，以葡萄糖為底物，通過糖酵解或磷酸戊糖途徑生成丙酮酸，之后經過TCA循環氧化生成L-蘋果酸，通過這一途徑，1摩爾葡萄糖可以合成1摩爾L-蘋果酸并釋放出2摩爾的CO2，最大理論得率為100%，得率η的計算公式為

η=[n(生成的L-蘋果酸)/n(初始葡萄糖)]

×100%

(1)

1.3 細胞代謝及產物分析

使用UV-2000型紫外分光光度計檢測細胞生長量，檢測波長為600 nm；利用P680型高效液相色譜儀檢測發酵液中有機酸，分析條件為：色譜柱為AcclaimTM120C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1 mol/L的KH2PO4，用H3PO4調節液體pH為2.8，進樣量為20 μL，紫外檢測波長為215 nm，柱溫為20 ℃，流速為1 mL/min。

2 結果與分析

2.1 敲除載體pTargetF-sgRNA的構建與鑒定

各個基因敲除載體pTarget-sgRNA的構建及驗證結果如圖2所示，其中圖2(a)中泳道1到泳道6及圖2(b)中泳道1分別為poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA敲除載體的pTargetF-sgRNA全質粒PCR檢測結果，上述質粒片段大小均與pTargetF相應值接近，約2000 bp左右；圖2(c)中泳道1到泳道6及圖2(d)中泳道1分別為poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA敲除載體的pTargetF-sgRNA全質粒PCR鑒定結果，檢測上游引物來自于pTargetF原始載體，下游引物來自各個基因相對應的20 bp sgRNA，上下游引物之間片段大小為536 bp。由檢測結果可知，擴增片段大小與預期相符。對經PCR鑒定的敲除載體進行測序的結果表明，含20 bp目的基因的片段已成功克隆至pTargetF載體。

(a)poxB、pta-ackA、ldhA等的檢測結果 (b)pfkA的檢測結果

(c)poxB、pta-ackA、ldhA等的鑒定結果 (d)pfkA的鑒定結果

2.2 上下游同源臂的制備結果與分析

敲除基因的上下游融合同源臂片段的制備結果如圖3所示，其中圖3(a)中泳道1到泳道6及圖3(b)中泳道1分別是poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA基因的上、下游同源臂的融合片段。由圖3可知，上述同源臂片段大小約為1000 bp，與預期一致，表明同源片段融合成功。

(a)poxB、pta-ackA、ldhA等的同源臂 (b)pfkA的同源臂

2.3 基因敲除菌株的構建結果與分析

基因敲除菌株利用引物P5/P8進行PCR鑒定的結果見圖4，其中圖4(a)中1泳道到6泳道為以野生型大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板并分別以poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA的P5/P8為引物的PCR鑒定結果，7泳道到12泳道為以重組菌株大腸桿菌基因組DNA為模板并分別以poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA的P5/P8為引物的PCR鑒定結果；圖4(b)中第1泳道為以野生型大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板并以pfkA的P5/P8為引物的PCR鑒定結果，第2泳道為以重組菌株大腸桿菌基因組DNA為模板并以pfkA的P5/P8為引物的PCR鑒定結果。因為poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA等基因的片段大小分別為1719、2284、2280、990、1698、3421、963 bp，基因上下游同源臂的融合片段大小約為1000 bp，若上述基因沒有敲除成功，相應擴增的片段大小應分別為2719、3284、3280、1990、2698、4421、1963 bp，即上下游同源臂加上基因本身片段大??；若基因敲除成功，擴增的片段大小均為1000 bp左右，即僅僅是上下游同源臂融合片段的大小。由圖4可知，圖4(a)中1泳道到6泳道及圖4(b)中1泳道所示poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA基因敲除前擴增片段大小與圖4(a)中7泳道到12泳道及圖4(b)中2泳道所示上述基因敲除后的相應片段大小之差正好與所敲除基因片段大小相同，這與預期相符，可以判斷相關基因已被成功敲除。

(a)以poxB、pflB、maeB等的P5/P8為引物 (b)以pfkA的P5/P8為引物

2.4 發酵液中有機酸分析

將野生型大腸桿菌MG1655及M04、M05、M06、M07菌株分別進行發酵處理，在搖瓶發酵48 h時對發酵液中的丙酮酸、L-蘋果酸、乳酸和乙酸進行了測定，結果如圖5所示。

圖5 發酵液中有機酸的檢測

從圖5中可以看出，對比野生型大腸桿菌MG1655菌株和菌株M04發酵處理后的發酵液檢測結果可以發現，野生型大腸桿菌MG1655菌株發酵后生成了較多的乳酸和乙酸等副產物，丙酮酸和L-蘋果酸的積累量分別只有0.675、0.812g/L，而菌株M04發酵液中乳酸和乙酸積累量大量減少，丙酮酸和L-蘋果酸的積累量分別達到5.621、4.012 g/L。這是因為菌株M04被敲除了丙酮酸副產物代謝途徑上的4個基因，造成生成副產物的代謝途徑被阻斷，從而丙酮酸得到了大量積累，同時，丙酮酸的積累又促進了TCA循環的加速，從而導致TCA循環中對應的中間產物如L-蘋果酸的積累量也相應增加。在菌株M04基礎上敲除基因maeA后，所得菌株M05經發酵處理后，發酵液中L-蘋果酸的積累量進一步增加至7.783 g/L，而丙酮酸的積累量則降低至4.016 g/L，這表明缺少蘋果酸酶maeA催化后，L-蘋果酸生成丙酮酸這一途徑得到了有效的抑制，L-蘋果酸的流失明顯減少。而對于進一步敲除了蘋果酸酶maeB的菌株M06來說，其發酵液檢測結果顯示L-蘋果酸的積累量相比M05相應值并沒有明顯的增加，這應該是此時菌株胞內NAD(P)H/NAD(P)+值過低，還原力不足所致。相比菌株M06發酵檢測結果，菌株M07發酵液中的丙酮酸積累量有所下降，但L-蘋果酸積累量明顯增加，達到了9.893 g/L，實際得率為66%，這是因為敲除菌株M06的pfkA基因后，能改善胞內還原力不足的狀況，有效提高胞內TCA循環速率。

2.5 基因敲除對細菌的生長影響

以M9培養基為發酵培養基，檢測了野生型大腸桿菌MG1655以及經基因敲除所得M06、M07菌株在發酵處理36 h時的生長情況及相應的葡萄糖消耗量，結果分別如圖6和圖7所示。結合圖6和圖7可見，上述3種菌株在發酵處理36 h時，M9培養基中的葡萄糖逐漸消耗殆盡，在此期間，三者按生長速率和葡萄糖消耗速率從大到小的排序為：野生型大腸桿菌MG1655、M07、M06菌株?？梢娤嚓P基因的敲除對細菌的生長造成了一定的影響，相比于野生型大腸桿菌MG1655，菌株M06和M07菌株的生長速率均有所下降，同時，由于pfkA基因的敲除使得M07菌株胞內氧化還原更加平衡，所以其生長速率較M06菌株相應值更大?？偟膩碚f，基于野生型大腸桿菌MG1655，進行相關基因敲除后對所得M07菌株的生長影響較小，后者具有成為生產L-蘋果酸的工程菌株的潛力。

圖6 菌株的生長曲線

圖7 菌株的葡萄糖消耗曲線

3 結論

(1)以pTargetF質粒做模板，借助引物通過全質粒PCR擴增，成功構建了基因敲除載體pTargetF-sgRNA。以大腸桿菌MG1655基因組為模板，借助引物擴增相關基因的上、下游同源臂，再以相關基因上、下游同源臂做模板，借助引物通過SOE-PCR進行擴增，成功制得相應基因上、下游同源臂的融合片段。

(2)在敲除載體構建完畢并制得同源臂片段后，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對野生型大腸桿菌MG1655進行基因敲除，依次敲除poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA基因后得到菌株M07，經好氧發酵48 h后所得L-蘋果酸積累量為9.893 g/L，得率為66%，相比野生型大腸桿菌MG1655相應值明顯增加，且基因敲除對該菌株的生長影響不大。