限食后重飼大鼠的骨密度變化及白藜蘆醇干預效果▲

王素星 邵偉華 李 偉 呂彩霞 張華星 李 芳

(河北省人民醫院1 老年病二科，2 老年病一科，3 醫務處，石家莊市 050051，電子郵箱：wangsuxing@126.com)

限食后的重飼是指短期熱卡限制后重新開放飲食，這可導致能量攝入的波動。不適當限食減肥后飲食反彈、疾病和疾病的康復等均伴隨熱卡攝取的波動[1]。人體的各種生理活動都離不開能量的支持，能量供應的量與質產生波動均可影響人體的各種生理活動，導致機體代謝發生一系列改變[2]。骨骼代謝與能量供給密切相關，慢性食物剝奪及兒童期營養不良均對骨代謝有負面影響。有研究顯示，營養剝奪可激活自噬，后者抑制成骨細胞分化增殖，促進破骨細胞分化[3]，進而負性調控骨代謝。白藜蘆醇是一種存在于紅酒中的多酚，可以抑制脂肪生成，刺激脂肪分解，增加脂肪酸氧化和熱生成[4]。同時，白藜蘆醇能明顯促進成骨細胞DNA合成，使成骨細胞內堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶活性明顯增加[5]，也可通過減輕氧化應激引起的損傷抑制骨質流失[6]，由此可見白藜蘆醇與骨代謝亦密切相關。雙能 X線吸收測量(dual energy X-ray absorptiometry,DEXA)的輻射量較小，具有更高的精確度，已經成為臨床上測量骨密度的常用方法[7]。本研究通過限制熱卡再快速恢復不同飲食模式的方法，建立限食后重飼成年大鼠模型，采用DEXA檢測全身骨密度，觀察能量供給改變過程中不同膳食模式重飼對骨密度的影響，以及白藜蘆醇的干預效應及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級SD雄性大鼠64只，體質量(160±20)g，購自河北醫科大學科研實驗動物飼養中心。實驗動物質量合格證號:SCXK(冀)2013-1-003。大鼠常規喂養。

1.2 試劑及儀器 電子秤(精確到0.1 g)購自佛山市順德區山和電子衡器有限公司(型號：SH0001)；血糖儀購自強生(中國)醫療器材有限公司(型號：ONE TOUCH UltraVue)；微量輸注泵購自浙江大學醫學儀器有限公司(型號：WZ-50G)；DEXA儀購自美國GE Lunar公司(型號Lunar iDXA)。重組人胰島素購自諾和諾德(中國)制藥有限公司(批號國藥準字：J20130021)；血清胰島素酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司(批號：E-EL-R2466c、E-EL-R1860c、E-EL-R0019c、E-EL-R0015c)。普通飼料購自河北醫科大學實驗動物學部，高脂飼料參考相關文獻[8]進行配制。白藜蘆醇(粉劑，純度99%，Sigma公司)用生理鹽水配制成15 mg/mL懸濁液備用。

1.3 研究方法 適應性喂養大鼠1周后，使用隨機數字表將其分為正常飲食組16只、限食后重飼組24只、限食后重飼+白藜蘆醇干預組24只。再將正常飲食組分為NC4組和NC12組各8只，整個實驗過程均給予正常飲食；限食后重飼組分為3個亞組各8例，即R4組(限食4周)、RN組(限食4周后給予正常飲食8周)、RH組(限食4周后給予高脂飲食8周)；限食后重飼+白藜蘆醇干預組分為3個亞組各8例，即R4R組(限食4周的同時給予白藜蘆醇干預)、RNR組(限食4周后給予正常飲食加白藜蘆醇8周干預)、RHR組(限食4周后給予高脂飲食加白藜蘆醇干預8周)。限食后重飼組及限食后重飼+白藜蘆醇干預組大鼠限食期間均給予60%正常飲食組大鼠的食量喂養；限食后重飼+白藜蘆醇干預組大鼠在飲食干預期間給予100 mg/kg白藜蘆醇灌胃，其他兩組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，直至實驗結束。分組示意圖見圖1。

圖1 分組示意圖

1.4 觀察指標

1.4.1 體重：每日稱量大鼠體重及食物攝入量(精確至0.1 g)。

1.4.2 全身骨密度測定：在實驗第4周末(NC4組、R4組、R4R組)和第12周末(RN組、RH組、RNR組、RHR組)，大鼠禁食過夜，精確稱量體重后，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，待大鼠肌力消失、呼吸平穩，仰臥位下用膠帶將大鼠四肢固定于硬紙板，采用DEXA儀從鼻尖掃描至尾端行全身骨密度測定。

1.4.3 高胰島素-正糖鉗夾試驗檢測：在實驗第4周末(NC4組、R4組、R4R組)和第12周末(RN組、RH組、RNR組、RHR組)，大鼠限食過夜后，參考文獻[9]，在大鼠清醒狀態下行尾動靜脈插管高胰島素-正糖鉗夾試驗(以下簡稱正糖鉗夾試驗)，檢測鉗夾60～120 min內葡萄糖輸注率(glucose infusion rate during 60 to 120 minutes,GIR60-120)。正糖鉗夾試驗開始前留取尾靜脈空腹血。

1.4.4 FFA、TNF-α、IL-6的檢測：取1.3.3留取的血標本，離心(3 000 r/min，15 min)，留取血清，采用ELISA檢測FFA、TNF-α、IL-6水平，所有操作均按試劑盒說明進行。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。符合正態分布的兩指標相關分析采用Pearson相關分析，不符合正態分布的兩指標相關分析采用Spearman相關分析。采用多元逐步回歸分析全身骨密度與各個變量之間的關系，同時行共線性檢驗，排除相關性強的影響因素。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 限食對大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實驗第4周末，NC4組、R4組、R4R組的體重、骨密度依次降低(均P<0.05)；NC4組、R4R組、R4組的血清FFA水平依次升高(均P<0.05)，而3組間GIR60-120差異無統計學意義(P>0.05)；R4組、R4R組的血清TNF-α和IL-6水平均低于NC4組(均P<0.05)，但R4組、R4R組差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 NC4組、R4組、R4R組各指標比較(x±s)

2.2 限食后重飼情況對大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實驗第12周末，RN組、RH組的體重均低于NC12組(均P<0.05)，但RN組與RH組差異無統計學意義(P>0.05)；RH組的骨密度低于其他兩組(均P<0.05)；NC12組、RN組、RH組GIR60-120依次降低，而血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 NC12組、RN組、RH組各指標比較(x±s)

2.3 限食后正常飲食及白藜蘆醇干預對大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實驗第12周末，NC12組、RN組、RNR組的體重依次降低，RNR組骨密度高于其他兩組(均P<0.05)；RNR組GIR60-120高于NC12組(P<0.05)；NC12組、RNR組、RN組的血清FFA、TNF-α水平依次升高，且RN組血清IL-6水平高于其他兩組(均P<0.05)。見表3。

表3 NC12組、RN組、RNR組各指標比較(x±s)

2.4 限食后高脂飲食及白藜蘆醇干預對大鼠體重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影響 實驗第12周末，NC12組、RH組、RHR組的體重依次降低，RH組、NC12組、RHR組的骨密度依次升高，NC12組、RHR組、RH組的GIR60-120依次降低，血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 NC12組、RH組、RHR組各指標比較(x±s)

2.5 影響骨密度的因素 取12周組大鼠，分析其骨密度與體重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平的相關性。相關分析結果顯示全身骨密度與體重、GIR60-120呈正相關(r=0.634，P<0.001；r=0.745，P<0.001)，與血清FFA、TNF-α、IL-6水平呈負相關(r=-0.721，P<0.001；r=-0.644，P<0.001；r=-0.613，P=0.013)。以骨密度為因變量，體重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平為自變量進行逐步回歸分析(均納入實際測量值進行分析)，結果顯示GIR60-120、FFA水平是影響全身骨密度的因素(均P<0.05)。見表5。

表5 骨密度影響因素的多因素分析

3 討 論

本研究中，RH組大鼠骨密度低于NC12組及RN組(P<0.05)，而NC12組及RN組差異無統計學意義(P>0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼可導致大鼠骨密度降低。研究表明，胰島素抵抗可影響1α-腎羥化酶的活性，以及腎臟對鈣、磷的調節，導致鈣流失增多；其還可以導致甲狀旁腺激素等激素分泌異常，進而影響骨代謝[10]。正糖鉗夾試驗中GIR60-120是評價胰島素敏感性的重要指標，本研究結果顯示，NC12、RN組、RH組的GIR60-120依次降低(P<0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼大鼠存在更為嚴重的胰島素抵抗；同時大鼠的GIR60-120與骨密度呈正相關，是骨密度的影響因素(P<0.05)，提示限食后給予高脂飼料重飼大鼠出現的更為嚴重的胰島素抵抗導致骨密度降低。有學者發現，脂肪酸對成骨細胞具有脂毒性作用[11],抑制脂肪細胞內脂肪酸的合成可以保護成骨細胞。有研究表明，營養變遷過程中內臟脂肪組織的脂質生成能力增強，而儲存能力相對不足[1]。本研究結果顯示，RN組及RH組大鼠分別給予正常飼料及高脂飼料重飼后FFA水平均升高(P<0.05)，考慮與脂質生成和儲存失衡導致的脂質外溢有關；同時，FFA水平與骨密度呈負相關(P<0.05)，提示血清中蓄積的FFA達到一定程度可能會對骨質產生破壞作用；而RH大鼠FFA水平高于RN組(P<0.05)，表明高脂飲食重飼后顯著升高的FFA水平可能是骨密度降低的影響因素之一。

核轉錄因子-κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)是腫瘤壞死因子超家族的成員，在破骨細胞前體向破骨細胞的分化中起著關鍵作用[12]，可以促進骨吸收。當機體存在炎癥反應時，TNF-α、IL-6等炎性物質使組織處于一種“慢性炎癥”環境中，RANKL表達上調，骨吸收被抑制。本研究中，分別給予正常飼料及高脂飼料重飼后，RN組和RH組大鼠的TNF-α、IL-6水平升高，且RH組的水平更高(P<0.05)。TNF-α、IL-6是經典的炎癥因子，因此我們推測高脂飼料重飼后出現骨密度降低，可能與其機體更為嚴重的炎癥反應對骨代謝影響更為明顯有關。

白藜蘆醇，化學名稱為3,5,4′-三羥基二苯乙烯，是一種結構類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[13]。研究顯示，白藜蘆醇在體外能與雌激素競爭性結合雌激素受體，具有雌激素/抗雌激素樣作用，被視為一種植物雌激素，而雌激素對骨質疏松有治療作用[14]。本研究結果顯示，與單純限食后重飼組(RN組及RH組)比較，限食后無論給予正常飼料還是高脂飼料重飼，白藜蘆醇干預組(RNR組及RHR組)的大鼠骨密度升高，且GIR60-120亦升高，FFA、TNF-α、IL-6水平均降低。這提示白藜蘆醇可能通過降低胰島素抵抗，減少FFA生成從而升高大鼠骨密度；同時白藜蘆醇還可能通過減少脂質外溢、減輕炎癥反應，進而糾正骨代謝的內環境，促進骨生成。此外，與單純限食后重飼組比較，限食后無論給予正常飼料還是高脂飼料重飼，白藜蘆醇干預組的大鼠體質量下降，但骨密度升高(P<0.05)。因此，我們認為獨立于體質量的重力負荷和機械刺激外，白藜蘆醇可能通過其他途徑發揮骨保護作用。有研究顯示，白藜蘆醇可通過多種途徑正性調控骨代謝。例如，核心結合因子α-1是最早發現且最具特異性的成骨標志物，沉默信息調節因子-1通過去乙酰化核心結合因子α-1，直接調節核心結合因子α-1，促進成骨細胞的增殖和分化[15]，而白藜蘆醇作為最有效的沉默信息調節因子-1的激活劑之一[6，16]，在該過程發揮重要作用。白藜蘆醇還可激活腺苷酸活化蛋白激酶，后者通過調節Wnt/β-連環蛋白信號通路影響成骨細胞功能[17]。但本研究結果亦顯示，限食4周的同時給予白藜蘆醇干預的R4R組大鼠骨密度低于單獨限食的R4組，出現這一現象的原因可能是：食物剝奪使得骨形成所需的基本原料減少，從而抑制了成骨細胞的活性；同時，相對嚴重的食物缺乏(減少40%的食物攝入)激活了機體能量守恒機制，能量被優先分配到關鍵器官，以確保生命的基本代謝活動，導致白藜蘆醇無法發揮骨骼的保護作用。因此，我們考慮白藜蘆醇的骨骼保護作用還依賴于機體能量供給。

綜上所述，與正常飲食重飼相比，高脂飲食重飼大鼠全身骨密度及胰島素敏感性下降更明顯，白藜蘆醇可能通過改善限食后重飼大鼠的胰島素抵抗，降低FFA生成及炎癥因子釋放，從而提高骨密度。但這種對骨骼的保護作用有賴于充足的營養供應，而白藜蘆醇在營養變遷大鼠模型中對骨代謝影響的具體分子生物學機制還需要進一步深入研究。