橡膠樹F3’H基因克隆及其功能分析

范月婷 辛士超 NAYCHIKoko 暢嬌 黃天帶 黃華孫 華玉偉

摘 ?要：從橡膠樹葉片轉錄組數據庫中調取花青素合成途徑中的關鍵酶類黃酮3-羥化酶（F3H）基因序列信息，通過RT-PCR擴增得到2個橡膠樹F3H基因，分別命名為HbF3H1和HbF3H2。通過熒光定量PCR分析發現，只有HbF3H1基因在不同發育時期的橡膠樹葉片和嫩莖中的表達水平與花青素的合成積累趨勢完全一致。HbF3H1所編碼的蛋白屬于P450超家族，具有保守的F3H結構域，而且HbF3H1基因的啟動子中包含多種環境效應元件，說明HbF3H1基因的表達受環境因子調控。通過農桿菌轉化煙草發現，過表達HbF3H1基因的煙草花瓣大量累積花青素，其顏色較非轉基因煙草顯著加深，同時，熒光定量PCR發現HbF3H1表達水平與轉基因煙草花瓣顏色呈正相關，說明HbF3H1基因表達促進花青素的累積。本研究為闡明橡膠樹花青素代謝途徑奠定基礎。

關鍵詞：橡膠樹;花青素;類黃酮3-羥化酶;轉基因煙草

中圖分類號：S794.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Based on the transcriptome database of rubber tree （Hevea brasiliensis） leaf tissues， we retrieved the nucleotide sequences of flavonoid 3-hydroxylase （F3H） gene， which is the key enzyme in anthocyanin biosynthesis pathways. Two rubber tree F3H genes， HbF3H1 and HbF3H2 were amplified by RT-PCR. The expression levels of the HbF3H genes were analyzed by quantitative real-time PCR and the expression of HbF3H1 were shown to be completely correlated with the anthocyanin contents in the deffirent developmental stage of leaves and stems. Amino acid sequence analysis results showed that HbF3H1 belonged to the super-family of cytochrome P450， and consisted of typical F3H conserved domains. In the promoter region of HbF3H1 gene， we observed multiple environment response elements， which revealed the possible role of HbF3H1 in environment stress resistance in rubber trees. HbF3H1 was over-expressed in tobacco （Nicotiana tabacum ‘Samsun NN） by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation for further functional verifications. Compared with the wild type control， the petals of transgenic tobacco lines exhibited enhanced red color pigmentation， which was positively correlated with the expression levels of HbF3H1. The results demonstrated that HbF3H1 played an important role in the biosynthesis of anthocyanin. The study would lay a foundation for understanding the anthocyanin biosynthesis pathways in rubber trees.

Keywords： rubber tree; anthocyanin; flavonoid 3-hydroxylase; transgenic tobacco

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.002

花青素屬類黃酮化合物，作為在植物中廣泛存在的水溶性天然色素，花青素的積累使花瓣和果實呈現多種顏色來吸引動物進行授粉和種子的傳播[1-2]。此外，花青素還具有多種重要的生理功能。在多種生物和非生物脅迫的響應過程中，植物會大量合成花青素并儲存于液泡中[3]。花青素的積累能夠減少昆蟲采食及病原菌侵染[4]。Hoch等[5]研究認為，植物幼枝和幼苗葉片中含有大量合成積累的花青素而呈現紅色，主要是為了過濾部分可見光和紫外線，以降低過量光照對植物的脅迫作用。同時，花青素的抗氧化活性有助于清除紫外、干旱和鹽脅迫等過程中所產生的活性氧自由基，以減少植物細胞所受到的傷害，從而增強植物的抗性[6-8]。低溫冷凍處理誘導蕪菁花青素合成酶基因BrANS的表達，促進花青素的合成積累以增強抗凍性[9]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是重要工業原材料天然橡膠的主要來源，主要種植于熱帶和亞熱帶地區。橡膠樹葉片的成熟需要12～20 d，分為古銅期、變色期、淡綠期和成熟期4個階段。橡膠樹易受多種環境脅迫的影響，同時也會合成積累大量花青素而使莖尖和嫩葉呈現古銅色[10-11]。通過分子生物學的方法研究橡膠樹中花青素合成相關基因，闡釋花青素積累的調控機制，對橡膠樹遺傳改良具有重要意義。本實驗室前期研究表明橡膠樹MYB轉錄因子能夠促進花青素的合成積累[12]，然而橡膠樹中花青素合成途徑中的關鍵酶基因卻并不明確。在植物中，類黃酮3-羥化酶（flavonoid 3-hydroxylase， F3H）是花青素合成過程中的關鍵酶之一，在決定植物花色、種皮和莖葉著色等性狀方面發揮著重要作用，F3H與F35H的比例決定著葡萄果實著色的程度[13]。F3H酶具有廣泛的底物特異性，可作用于山萘酚、芹菜素和柚皮素，催化這些中間產物轉變為B環-3，4-二羥基黃酮類化合物圣草酚、二氫槲皮素和槲皮素，從而使其具有更強的抗氧化活性[6， 14-16]。

本研究克隆得到2個橡膠樹F3H基因的cDNA全長序列，并分析2個基因在橡膠樹葉片和嫩莖中的表達模式。對HbF3H基因的序列進行了生物信息學分析，并通過轉化煙草驗證其生理功能，從而為橡膠樹中花青素的合成調控和功能研究奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

巴西橡膠樹‘熱研7-33-97種植于中國熱帶農業科學院橡膠研究所國家橡膠樹種質資源圃。取黑暗和正常光照條件下（光照強度3000 lx，周期12 h/d）橡膠樹的幼苗嫩莖及古銅期、淡綠期、變色期、穩定期4個時期的葉片，用于橡膠樹F3H基因的克隆及表達分析。煙草（Nicotiana tabacum ‘Samsun NN）種子滅菌后，于MS培養基萌發（光照強度4000 lx，周期14 h/d），取8葉齡煙草葉片用于轉基因試驗。RNA提取試劑盒EasyPure RNA Kit、cDNA第一鏈的合成試劑盒TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix及熒光定量PCR試劑盒TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。植物基因組DNA抽提試劑盒Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit及大腸桿菌感受態DH5-α購于生工生物工程（上海）股份有限公司。TA克隆載體pMD-19T、DNA聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase和rTaq Premix購于TaKaRa生物有限公司（日本）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?橡膠樹F3H基因及啟動子片段的克隆 ?依據橡膠樹古銅期葉片轉錄組數據庫篩選得到2條橡膠樹F3H基因序列，在此基礎上設計特異性引物CDS-F3H1和CDS-F3H2，引物序列見表1。提取橡膠樹古銅期葉片總RNA，以總RNA反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得目標基因片段。HbF3H1啟動子的克隆，以橡膠樹葉片基因組DNA為模板，使用表1中的proHbF3H1引物進行PCR擴增，最后獲得啟動子片段。將獲得的目標基因片段和啟動子片段純化回收后通過TA克隆構建到pMD 19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5-α感受態細胞，通過重組單克隆測序獲得2個橡膠樹F3H基因全長編碼框序列和HbF3H1上游啟動子序列。

1.2.2 ?橡膠樹F3H基因在橡膠樹葉片和嫩莖中的表達分析 ?在橡膠樹中，以HbRH8作為熒光定量PCR的內參基因[17]。使用橡膠樹古銅期、變色期、淡綠期和穩定期4個時期的葉片以及光培養和暗培養橡膠樹的嫩莖cDNA為模板，使用表1中的定量PCR引物Q-HbF3H1和Q-HbF3H2，在Light Cycler 2.0熒光定量PCR儀（Roche公司）中進行熒光定量PCR反應。熒光定量結果采用2-CT方法分析。

1.2.3 ?HbF3H1基因及其啟動子的序列分析 ?通過NCBI/blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）對橡膠樹HbF3H1基因編碼的氨基酸序列進行同源序列查找，同時預測其保守域。利用多序列比對軟件DNAMAN進行氨基酸序列比對。通過Plant Care（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plant-care/html/）對HbF3H1基因啟動子片段序列進行分析。

1.2.4 ?煙草轉化及陽性株系的鑒定 ?使用Sal I和Sma I進行雙酶切，將HbF3H1基因CDS構建到pCAMBIA2301載體上，位于2×35S啟動子下游，得到過表達載體pCAMBIA2301-HbF3H1（圖1），轉化到農桿菌GV3101中用于煙草轉基因試驗。煙草的轉化參照Pattanaik等[18]的方法。農桿菌侵染煙草葉盤后，共培養3 d，放置含有卡那霉素的分化培養基上進行愈傷組織的培養和抗性篩選，每2周更換一次培養基，直至長出幼苗。剪取幾片葉子進行GUS染色分析。同時，提取轉基因煙草基因組作為模板，使用表1中CDS-F3H1引物，對轉基因煙草株系進行PCR驗證。以轉基因煙草的花瓣cDNA為模板，使用表1中Q-HbF3H1引物進行熒光定量PCR，分析轉基因煙草花瓣中HbF3H1基因的表達水平。

2 ?結果與分析

2.1 ?橡膠樹F3H基因的克隆

以橡膠樹總RNA反轉錄后的cDNA為模板，使用表1中F3H的基因克隆引物進行PCR擴增，得到2個與預期大小相一致的目的基因片段，分別將其命名為HbF3H1和HbF3H2（圖2）。測序得到該基因開放讀碼框核苷酸序列，HbF3H1長度為1578 bp，編碼525個氨基酸;HbF3H2長度為1566 bp，編碼521個氨基酸。

2.2 ?橡膠樹F3H基因的表達分析

橡膠樹葉片的發育分為古銅期、變色期、淡綠期和穩定期4個階段，在這個過程中，葉片顏色由紫紅色轉變為綠色，古銅期葉片花青素提取液較穩定期的深，而光照培養體胚植株嫩莖花青素提取液較暗培養的深（圖3）。同時，在本實驗室前期的研究中，已經分別測定了橡膠樹古銅期和穩定期葉片、黑暗和光照培養體胚植株嫩莖的花青素含量分別為361.0000、24.8095、40.3045、33.0793 μg/g，不同時期和組織的橡膠樹花青素含量測定說明花青素含量與顏色的深淺呈正相關[19-20]。因此，為了探索橡膠樹F3H基因在花青素合成中的生理功能，本研究以克隆到的2個橡膠樹HbF3H基因序列為模板，設計熒光定量分析引物（表1），通過熒光定量PCR分析了橡膠樹葉片以及光照培養和暗培養橡膠樹幼苗嫩莖中F3H基因的表達情況。在橡膠樹中，從古銅期至穩定期，隨著葉片紅色逐漸褪去，HbF3H1基因的表達量顯著下降（圖4）。暗培養條件下的橡膠樹幼苗嫩莖呈暗紅色，而光照培養條件下的幼苗嫩莖呈綠色，在暗培養條件下橡膠樹嫩莖中HbF3H1基因的表達水平顯著高于光照培養條件下的橡膠樹嫩莖（圖4）。結果表明HbF3H1基因在葉片和嫩莖中的表達水平與花青素的累積趨勢較為一致，因此，推斷HbF3H1基因為橡膠樹花青素合成中的關鍵因素，可用作后續的序列分析和功能驗證。

2.3 ?HbF3H1基因啟動子克隆和序列分析

根據橡膠樹基因組數據設計HbF3H1啟動子擴增引物proHbF3H1（表1），以橡膠樹葉片DNA為模板擴增該基因上游啟動子片段，通過測序獲得該上游啟動子核苷酸序列長2.5 kb（圖2）。

通過Plant Care分析HbF3H1基因啟動子序列，結果發現該啟動子片段中存在大量的光、溫度等環境響應元件，這說明HbF3H1基因的表達可能同樣受光照、溫度等多種環境因素的影響（表2）。

2.4 ?橡膠樹HbF3H蛋白序列比對分析

通過NCBI/blastp和多序列比對軟件DNAMAN對橡膠樹HbF3H1基因編碼的氨基酸序列進行同源序列查找、比對。結果表明，橡膠樹HbF3H1蛋白屬于P450超家族（圖5A），其氨基酸序列與大豆、麻風樹、木薯、葡萄和玉米的F3H蛋白具有較高的同源性，且均包含有類黃酮3-羥化酶所必需的膜錨定序列、底物選擇和結合位點及與血紅素結合位點（圖5B）。

2.5 ?HbF3H1基因在煙草中的功能驗證

通過農桿菌介導的葉盤法轉化煙草，篩選抗卡那霉素煙草株系，然后取葉片進行GUS染色及基因組PCR驗證。轉基因煙草葉片GUS染色后變為藍色（圖6A），基因組PCR擴增得到HbF3H1基因目標條帶，證實已成功獲得多個含HbF3H1基因的轉基因煙草株系（圖6B）。與野生煙草相比，轉基因煙草花瓣組織花色加深（圖7A），熒光定量PCR結果表明其花色深淺程度與HbF3H1基因的表達水平呈正相關（圖7B），初步確定橡膠樹HbF3H1基因的表達可促進煙草花瓣中花青素的合成積累。

3 ?討論

花青素是植物中的一種重要次生代謝產物，主要積累在花、葉片和果實等器官中，使其呈現豐富多彩的顏色。此外，花青素還具有抗氧化、抗蟲、光保護和滲透調節等多種保護作用[21]。目前，在橡膠樹中已鑒定出一個調控花青素合成的R2R3-MYB轉錄因子基因HbAn1，在煙草中過表達該轉錄因子能夠上調花青素合成中多個關鍵酶基因的表達[12]。但在橡膠樹中的花青素合成相關酶的基因還未有詳細報道。本研究從橡膠樹中克隆得到2個類黃酮3-羥化酶基因，研究這2個基因的表達模式，并進一步對HbF3H1基因進行了序列分析以及在煙草中的功能驗證。不同時期橡膠樹葉片以及光照培養和暗培養橡膠樹嫩莖中的表達分析表明，HbF3H1基因的表達水平與花青素積累趨勢較為一致。通過轉化煙草發現，過表達HbF3H1能夠促進轉基因煙草花瓣中花青素的合成積累而使顏色加深。這證實了HbF3H1基因參與橡膠樹花青素合成的生理功能。

氨基酸序列比對結果發現，橡膠樹HbF3H1基因屬于植物中廣泛存在的細胞色素P450超家族。P450超家族蛋白具有廣泛的催化活性，主要參與多種代謝途徑的生物合成以及催化外源化合物，如除草劑、殺蟲劑、污染物等轉變為非毒性產物[22]。通過分析橡膠樹HbF3H1基因的啟動子區發現除了包含大量的光效應元件外，還有缺氧響應元件GC-motif和ARE、低溫響應元件LTR和多個熱應答元件HSE等多種逆境脅迫應答元件，這表明HbF3H1基因可能參與橡膠樹非生物脅迫應答反應。Toda等[23]發現，低溫能夠促進大豆F3H1基因的表達。在水稻中，OsF3H基因的表達受到光照的誘導[24]。最近研究發現，低溫處理能夠明顯上調蠟梅CpF3'H基因的表達[25]。杭菊CmF3'H基因的表達對淹水脅迫有明顯的響應[26]。在植物響應逆境脅迫的過程中，F3H酶催化花青素合成途徑中的中間產物，使其具有更強的抗氧化活性，從而高效的清除紫外光等一系列逆境脅迫條件下細胞內產生的活性氧（ROS），減少細胞所受到的傷害，增強抵抗環境脅迫的能力[7-8]。

因此，研究橡膠樹中花青素的代謝途徑以及脅迫條件下的合成調控的分子機制對于推動橡膠樹抗逆分子育種有著重要的意義。同時，花青素作為植物中重要的成色物質，將其作為遺傳轉化的篩選標記可實現實時活體監測，具有簡單便捷、檢測成本低廉等特點[27-30]。本研究為橡膠樹抗逆轉基因育種提供潛在的基因資源，也為橡膠樹轉基因高效可視化篩選奠定基礎。

4 ?結論

本研究在橡膠樹基因組和轉錄組測序結果的基礎上，克隆得到2個橡膠樹HbF3H基因。在不同時期橡膠樹葉片以及光培養和暗培養嫩莖中，HbF3H1基因的表達水平與花青素累積完全一致。HbF3H1基因所編碼的氨基酸及其啟動子序列發現，HbF3H1蛋白具有保守的F3H結構域，其啟動子序列中包含多種環境效應元件，說明HbF3H1基因可能參與橡膠樹對環境脅迫的響應。在煙草中過表達HbF3H1基因能夠提高轉基因煙草花瓣中的花青素含量，使其花色明顯加深。這些結果證明了HbF3H1基因能夠參與橡膠樹花青素合成的生理功能。

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