面向培養科研能力的研究與創新實驗設計與實踐

靳 明， 景雪拳， 韋麗紅， 白國義， 楊瑜濤

（河北大學a.化學國家級實驗教學示范中心；b.化學與環境科學學院，河北保定071002）

0 引 言

實驗教學是高等教育中的重要實踐教學環節，是培養學生創新能力、實踐能力和綜合素質的重要教學手段［1-2］。化學是一門以實驗為基礎的學科，實驗教學在學生培養方案中占有非常高的比例。化學實驗教學對于學生的知識、能力、思維和素質的協調發展起著至關重要的作用，在整個化學教育教學過程中占有特殊的地位。傳統的實驗教學是學生按照教科書提供的實驗方案，在教師的指導下完成實驗，能夠培養學生的基本實驗技能，但實驗內容與科研前和實際應用聯系較少，學生的創新實踐能力和綜合能力得不到充分的鍛煉和提高。研究與創新實驗是集多學科性、創新性、研究設計性和綜合性實驗技能于一體的實驗課程，不僅培養學生實驗操作技能，關鍵是縮小學生所學專業基礎知識與科研、生產實踐中解決實際問題能力之間的差距，達到增強學生科研能力、實踐能力和創新能力的目標。因此，當前在高校積極開展研究與創新實驗尤為必要，國內諸多高校也在此思路上進行了探索和實踐［3-12］。

1 實驗設計思路

香豆素是一類常見的熒光染料，合成方法簡便，熒光團易于修飾，波長范圍易于拓展，量子產率高，已廣泛應用于熒光探針領域。在前期工作的基礎上［13-15］，利用8-羥基久洛尼定和苯并噻唑的剛性平面結構增強了香豆素的熒光母體探針的平面性，設計了一種新的香豆素-苯并噻唑熒光探針，并以此開展本科生研究與創新實驗。整個實驗過程如下：①通過4 步有機合成反應制備探針分子，合成路線如圖1 所示。4 個不同反應涉及有機反應中的不同化學反應，學生可利用已掌握的知識或是查閱文獻的方式了解其反應機理，利用SciFinder查找反應路線，不同組的同學嘗試不同的反應路線，最后對比了解最佳方式；②對探針分子進行分離、純化與表征；③對探針分子的紫外和熒光光譜性質進行分析探討。整個實驗過程中，學生不僅學習鞏固了有機化學和波譜學理論知識，學會了抽濾、萃取和硅膠色譜柱等有機化學基本操作，還掌握了儀器分析化學中的紫外-可見分光光度計和熒光光譜儀等儀器的使用和Origin 等數據處理方法。另外，此實驗還可以通過探針溶液前后顏色變化，把實驗現象和光譜的理論知識結合起來，讓學生更直觀地觀察到實驗現象變化，教學效果良好，有利于激發學生的學習科研興趣，提高科研創新能力。

圖1 探針分子的合成路線

2 實驗目的和實驗試劑、儀器

2.1 實驗目的

通過文獻檢索，學會中外數據庫的使用，了解香豆素衍生物熒光探針的研究進展、合成方法以及應用前景；掌握加熱、過濾、重結晶、萃取、柱層析等基礎的合成實驗方法操作和技能；掌握縮合、成環、鹵化、氧化等經典有機反應，并能進行一些簡單的探針設計；熟練磁力攪拌器、旋轉蒸發儀、紫外-可見分光光度計和熒光光譜儀等儀器的操作；了解核磁共振儀和質譜儀的檢測原理；學會核磁、質譜、紫外和熒光等儀器使用及Origin等數據處理和圖譜分析方法；培養學生獨立分析和解決問題的能力，提高學生的科研創新能力。

2.2 實驗儀器和試劑

儀器：茄形瓶、磁力攪拌器、油浴盆、層析柱、蛇形冷凝器、錐形瓶、電子天平、循環水真空泵、旋轉蒸發儀、AVANCE Ⅲ型核磁共振儀（瑞士布魯克），Cary 60型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫），Cary Eclipse型熒光光譜儀（美國安捷倫）。

試劑：苯酚、丙二酸、三氯氧磷、哌啶、甲苯、8-羥基久洛尼定、正己烷、氫氧化鈉、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），氯化鈉、乙腈、無水乙醇、苯并噻唑鹽、無水硫酸鈉、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、不同陰離子溶液、GSH、Hcy、Cys。

3 實驗實施步驟

3.1 化合物2 的合成

在150 mL圓底燒瓶中加入苯酚（10.6 mmol，1.00 g）和丙二酸（5.3 mmol，0.55 g），接著向其中慢慢加入POCl3（6.15 mmol，0.58 mL），在0 ℃下攪拌30 min，慢慢將混合物加熱至120 ℃，直至沒有HCl氣體生成后，將混合物冷卻至室溫，將反應物倒入100 mL 水中，用乙酸乙酯萃取3 次，收集有機相，加入無水硫酸鈉干燥后濃縮得到白色固體化合物2（1.12 g，產率87.5%）。

3.2 化合物3 的合成

將化合物2（4 mmol，1.02 g）置于100 mL圓底燒瓶，加入甲苯（10 mL）溶解，接著加入8-羥基久洛尼定（4 mmol，0.75 g），在110 ℃下攪拌回流10 h，冷卻至室溫，過濾，正己烷洗滌多次得到化合物3（0.94 g，產率91.2%）

3.3 化合物4 的合成

在N2保護下，將POCl3（3 mL）慢慢滴加到無水DMF（3 mL）中，室溫攪拌30 min，得到紅色液體。將紅色溶液逐滴加入到化合物3（3.5 mmol，0.90 g）的DMF（5 mL）溶液中，60 ℃下攪拌10 h后，將反應液倒入50 mL 水中，用30%的NaOH 溶液將溶液調節至pH ＝5，有大量紅色沉淀產生，過濾，將粗產品進行柱層析分離提純（PE∶EA ＝1∶1）得到紅色固體化合物4（0.76 g，產率72.2%）。

3.4 探針的合成

將化合物4（1. 0 mmol，0. 30 g）和苯并噻唑鹽（1.1 mmol，0.31 mg），用無水乙醇（25 mL）溶解，加熱回流攪拌12 h，將反應液冷卻至室溫，抽濾得到固體，用無水乙醇充分洗滌，得到探針化合物1（0.37 g，產率83%）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8. 33（d，J ＝7.8 Hz，1H），8.17 ～8.23（m，2H），8.03（d，J ＝15.0 Hz，1H），7.82（t，J ＝15.6 Hz，1H），7.73（t，J ＝15.0 Hz，1H），7.41（s，1H），4.18（s，3H），3.42（d，J ＝5.4 Hz，4H），3.72 ～3.77（m，4H），1.88 ～1.91（m，4H），13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ 157.9，151.1，149.9，149.8，146.7，142.1，139.9，129.3，128.1，127.4，124.2，124.1，121.6，116.5，112.9，107. 9，107. 1，104. 9，50. 0，49. 4，35. 9，26.8，20.3，19.5，19.3。

4 結果與討論

4.1 紫外可見吸收光譜分析

圖2 探針分子（10 μmol／L）對陰離子及小分子生物硫醇（100 μmol／L）的響應的紫外光譜圖

4.2 熒光光譜分析

如圖3 所示，在DMF-PBS（v／v ＝1／10，PBS，10 mmol／L，pH 7.4）緩沖溶液中，利用熒光光譜分析了探針分子對上述分析物的識別性能。選擇等吸收點470 nm 為激發波長，熒光探針在665 nm 處有強的發射波長，當加入時，762 nm處熒光減弱，556 nm有強的熒光發射出現，溶液的熒光顏色由紫紅色變為綠色，其他分析物并未發生明顯變化，結果表明，熒光探針對識別有高選擇性。

圖3 探針分子1（4 μmol／L）對陰離子及小分子生物硫醇（40 μmol／L）的響應的熒光光譜圖（激發波長為470 nm，狹縫：10 nm／10 nm）

圖4 的熒光滴定圖

最后，利用熒光光譜研究了pH 值對探針分子識別性能的影響。如圖5 所示，探針分子在pH 3 ～11 范圍內，I665nm／I556nm沒有明顯變化，說明探針分子有良好的耐酸堿性，比較穩定，隨著的加入，發現I665nm／I556nm在pH 6 ～11 范圍內發生明顯變化，表明探針分子在較寬的pH 值范圍內，可實現對范圍內的識別檢測。

圖5 pH值對探針熒光強度的影響

5 結 語

通過香豆素—苯并噻唑熒光探針的設計、合成及對亞硫酸氫根的檢測實驗，學生掌握了大量的有機化學和波譜學理論知識，尤其經過最初的設計、理論論證、實踐實驗檢驗反饋、再次理論指導設計、實驗再檢驗等理論實踐相互交替輪流驗證中，學生理論知識得到進一步提高，實驗結果又進一步驗證理論知識，提高了分析問題解決問題的能力。通過不斷地實驗和儀器的使用及數據的處理，增強了學生的動手能力。查找諸多有機反應機理，更是讓學生親身體會到理論到實際再到理論的過程。

近年來，受該實驗啟發，學生求知欲和自主探究問題能力增強。作為本科生，設計了諸多新穎熒光探針，如識別室內甲醛、環境中硫化物、水中重金屬離子和生物體內小分子硫醇等，并多次成功申請到大學生創新創業項目、實驗室開放項目及發表科研論文［15-16］，提高了學生的科研能力和創新能力。