紫外可見分光光度法測定植物葉中甲醛脫氫酶活性的教學實驗設計

楊玉霞， 李德鵬， 梁含笑， 蘇玉紅

（新疆大學化學化工學院，烏魯木齊830046）

0 引 言

綜合性實驗是指在學生具有一定基礎知識和基本操作技能的基礎上運用某一課程或多門課程的綜合知識，對學生操作技能和實驗方法進行綜合訓練的一種復合性實驗［1-6］。設計性實驗是指給定實驗目的、要求和實驗條件，由學生查閱文獻資料，自行設計、改進或完善實驗方案，準備實驗儀器和藥品、獨立進行實驗操作，完成實驗目的，并書寫實驗報告的實驗［7-11］。實驗教學在理工科教育教學中占據重要的地位，在高校相關專業的課程中適當增加綜合性、設計性實驗課程，有利于提高學生學習的主動性和積極性，增強學生的實踐動手能力，提高學生探索新問題的興趣、認識事物的綜合能力以及設計實驗的能力，可初步培養學生的科學研究思維，從而為后續本科畢業設計（論文）、學業深造及就業培養應用型人才打下良好基礎。

分析實驗是化學、生物、環境等專業本科生的一門基礎必修課程，其中紫外可見分光光度法的相關實驗被廣泛設立。紫外可見分光光度法具有成本低、操作簡單、分析速度快、選擇性好、精密度、準確度及靈敏度高等優點，能夠對多種無機和有機物質進行定性、定量分析，因而被廣泛應用于物理、化學化工、生物、材料、環境、醫藥、冶金等領域的生產與管理部門［12-15］。因此，在項目組前期科研工作的基礎上，設計了一個基于紫外可見分光光度法的綜合性實驗，并已用于我校化學專業三年級學生的教學實踐中，在拓展學生專業理論知識的同時，達到了提高學生分析問題、解決實際問題能力的目的。

1 實驗設計思路及意義

文獻調研結果表明，甲醛脫氫酶作為一種甲醛轉化的主要催化劑，廣泛存在于植物葉中，但其活性大小差異顯著不同，在植物凈化空氣中的甲醛時，甲醛脫氫酶占據重要地位［16-18］。溶膠-凝膠法是目前溶液中甲醛脫氫酶的主要固定化方法，此方法定性比較準確，但機理和操作復雜、包埋困難、重復性差，難以應用于本科類教學，也難以用于定量分析［｀19-20］。

鑒于此，建立了一種基于紫外可見分光光度法測定植物葉片中甲醛脫氫酶活性的評價方法，經教學實踐表明，應用于化學專業高年級本科生實驗課教學，可取得良好的教學效果。此實驗設計用于高年級本科生，具有可行性強、重現性好、多層次、開放式、研究型創新的特點，同時兼具方案可部分自主性設計、實驗內容切合社會熱點問題、實驗結果實用性強的優點，有效地激發了學生的實驗積極性和主動性。

2 實驗原理

甲醛是一種室內空氣中常見的污染物，具有強致癌性。綠色植物能有效凈化室內空氣中的甲醛，因此在改善室內空氣質量方面得到了廣泛應用［21-22］。蛋白質在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等作用下會發生變性。甲醛脫氫酶的化學本質是二聚體蛋白質，在高溫時甲醛脫氫酶易失去活性。因此，本實驗利用酶的熱不穩定特點，采用高溫處理的方式制備失活提取液，消除新鮮提取液中甲醛脫氫酶的活性；通過在不同提取液中外加甲醛溶液，檢驗一定時間后甲醛含量變化的方式來間接估測植物中有效成份對外加甲醛的凈化能力；根據新鮮提取液和失活提取液對外加甲醛凈化能力間的差異，評價植物葉中甲醛脫氫酶的活性大小。

溶液中甲醛濃度的測定，參照中華人民共和國國家環境保護標準HJ601-2011，采用乙酰丙酮分光光度法。基本原理為：甲醛在乙酸-乙酸銨緩沖溶液中與乙酰丙酮反應，生成穩定的黃色化合物，其用紫外可見分光光度計測定的最大吸收波長在414 nm 附近［23-25］。化學反應式為：

3 主要試劑及儀器

3.1 主要試劑

（1）乙酰丙酮溶液。將125.000 g 乙酸銨、15.00 mL冰乙酸及1.25 mL乙酰丙酮試劑攪拌、溶解后定容于250.00 mL容量瓶中。

（2）甲醛使用液。取0. 70 mL 甲醛（含甲醛37% ～40%）定容到250 mL容量瓶中，用已知準確濃度的硫代硫酸鈉溶液，標定其準確濃度。取上述標定溶液25.00 mL稀釋、定容至100 mL容量瓶中待用。

（3）磷酸鹽緩沖液。稱取磷酸二氫鈉3.120 g 蒸餾水定容至100 mL 容量瓶，磷酸氫二鈉35.900 g 定容至500 mL 容量瓶，混合后用酸度計調節pH 至7.80。

3.2 主要儀器

TDL-50 電動離心機（江蘇金壇儀器廠）；HH-WL恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；BSA224S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；Eppendorf微量移液器：10 ～100 μL 和200 ～1 000 μL（北京華威中儀科技有限公司）；T6 新世紀紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

4 實驗步驟

4.1 植物樣品的采集和前處理

實驗所需的植物葉片樣品均由學生在校內草坪、花園、荒地及校外公園空氣清新、土壤無污染歷史處采集，新鮮樣品經冰盒保鮮短途運送回實驗室后，立即用預冷的自來水和蒸餾水清洗表面、拭干、準確稱量處理好的植物樣品2.000 g，將瓷研缽置于冰盒上，分4 次加入40.00 mL在0 ～4 ℃預冷12 h的磷酸鹽緩沖液，快速研磨以提取出新鮮植物葉片中的有效成份，每次分離出的新鮮提取液轉移至預冷的50.00 mL 離心管中，混勻后在0 ～4 ℃條件下離心10 min，將上清液分成兩份，一份立即進行新鮮提取液凈化外加甲醛實驗，另一份置于試管中放入100 ℃沸水中加熱10 min，取出后冷卻離心，然后進行失活提取液凈化外加甲醛實驗。

4.2 校準曲線的繪制

取6 支具塞玻璃試管，分別加入0、41.67、71.43、93.75、111.11、138.89 μg／mL 甲醛使用液，然后在上述比色管中分別加入1.00 mL乙酰丙酮溶液，定容至10.00 mL，搖勻后，放置于60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻、過濾、稀釋，在波長414 nm 處，以水為參比測定其吸光度。以吸光度值為縱坐標，試管中甲醛濃度為橫坐標，繪制標準曲線。如圖1 所示，曲線方程y ＝0.011 1x-0.063 6，相關系數R2＝0.990 4。

圖1 吸光度與甲醛濃度相關的標準曲線

4.3 外加甲醛凈化實驗

在12 個具塞玻璃試管中分別加入1.00 mL 離心后的新鮮或失活植物提取液，分別加入0、41. 67、71.43、93.75 μg／mL 的甲醛使用溶液（每個濃度做3次），再分別加入1.00 mL 乙酰丙酮，蒸餾水定容至10.00 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中加熱15 min 后，冷卻、過濾、稀釋后，在波長414 nm處，以水為參比，測定濾出液的吸光度值。每位學生任選兩種植物樣品，完成外加甲醛凈化實驗。

4.4 數據處理與結果分析

4.4.1 數據計算與處理

根據標準曲線，測定出凈化實驗中不同條件下植物提取液（新鮮或失活）對外加甲醛的凈化能力；進而根據植物樣品質量和提取液體積，計算出不同條件下單位質量植物葉對外加甲醛的凈化量，單位為μg／kg FW（鮮重）；依據同種植物新鮮提取液與失活提取液間凈化量的差值（ΔK），ΔK 值與甲醛脫氫酶活性呈正相關，判斷出植物葉中甲醛脫氫酶活性大小。

4.4.2 結果分析

依據13 個本科生分別測定的4 種植物提取液中甲醛脫氫酶活性大小的數據作圖（見圖2），由圖可見，不同學生測定的同種植物提取液中甲醛脫氫酶活性大小具有相同的規律，三葉草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，呈現增長趨勢；鵝腸草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，出現先增長后降低最后持續增長的趨勢；灰灰草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，與三葉草呈現相同趨勢；蜀葵提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，逐漸降低，實驗結果表明“紫外分光光度法測定植物葉片中甲醛脫氫酶活性”的本科教學實驗設計具有良好的重現性。

圖2 4種植物提取液中甲醛脫氫酶去除甲醛量

5 結 語

在實踐中培養本科生的創新精神和創新能力，是高等教育日益發展進步所必需的。本文所選的實驗教學課題，以學生們熟悉并關心的空氣中甲醛污染及其植物凈化為導向和切入點，基于基礎教學中普遍學習的紫外可見分光光度計的使用，已成功地將“紫外光度法測定植物葉中甲醛脫氫酶活性”的綜合性實驗應用于化學專業本科高年級學生的實踐教學中，一方面有效地調動了學生實驗的積極性和主動性，另一方面進一步加深了學生對紫外可見分光光度計理論知識和實際應用的理解；通過明確的實驗目的及實驗教學中對實驗設計思路、意義、原理以及實驗結果分析的論述，達到在強化技能性基本操作實驗訓練的同時，提高學生發現問題、分析問題和解決問題能力的教學目的；實驗設計的內容具有學科交叉的特色，既突出了化學專業的特色，也適用于環境科學與工程及生物科學技術等相關專業的高年級本科生課堂教學。