紫外可見分光光度法測(cè)定植物葉中甲醛脫氫酶活性的教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

楊玉霞， 李德鵬， 梁含笑， 蘇玉紅

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，烏魯木齊830046）

0 引 言

綜合性實(shí)驗(yàn)是指在學(xué)生具有一定基礎(chǔ)知識(shí)和基本操作技能的基礎(chǔ)上運(yùn)用某一課程或多門課程的綜合知識(shí)，對(duì)學(xué)生操作技能和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合訓(xùn)練的一種復(fù)合性實(shí)驗(yàn)［1-6］。設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)是指給定實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁蠛蛯?shí)驗(yàn)條件，由學(xué)生查閱文獻(xiàn)資料，自行設(shè)計(jì)、改進(jìn)或完善實(shí)驗(yàn)方案，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)儀器和藥品、獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，完成實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鴮憣?shí)驗(yàn)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)［7-11］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)在理工科教育教學(xué)中占據(jù)重要的地位，在高校相關(guān)專業(yè)的課程中適當(dāng)增加綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課程，有利于提高學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性和積極性，增強(qiáng)學(xué)生的實(shí)踐動(dòng)手能力，提高學(xué)生探索新問題的興趣、認(rèn)識(shí)事物的綜合能力以及設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的能力，可初步培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究思維，從而為后續(xù)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）、學(xué)業(yè)深造及就業(yè)培養(yǎng)應(yīng)用型人才打下良好基礎(chǔ)。

分析實(shí)驗(yàn)是化學(xué)、生物、環(huán)境等專業(yè)本科生的一門基礎(chǔ)必修課程，其中紫外可見分光光度法的相關(guān)實(shí)驗(yàn)被廣泛設(shè)立。紫外可見分光光度法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、分析速度快、選擇性好、精密度、準(zhǔn)確度及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)Χ喾N無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，因而被廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)化工、生物、材料、環(huán)境、醫(yī)藥、冶金等領(lǐng)域的生產(chǎn)與管理部門［12-15］。因此，在項(xiàng)目組前期科研工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一個(gè)基于紫外可見分光光度法的綜合性實(shí)驗(yàn)，并已用于我校化學(xué)專業(yè)三年級(jí)學(xué)生的教學(xué)實(shí)踐中，在拓展學(xué)生專業(yè)理論知識(shí)的同時(shí)，達(dá)到了提高學(xué)生分析問題、解決實(shí)際問題能力的目的。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路及意義

文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果表明，甲醛脫氫酶作為一種甲醛轉(zhuǎn)化的主要催化劑，廣泛存在于植物葉中，但其活性大小差異顯著不同，在植物凈化空氣中的甲醛時(shí)，甲醛脫氫酶占據(jù)重要地位［16-18］。溶膠-凝膠法是目前溶液中甲醛脫氫酶的主要固定化方法，此方法定性比較準(zhǔn)確，但機(jī)理和操作復(fù)雜、包埋困難、重復(fù)性差，難以應(yīng)用于本科類教學(xué)，也難以用于定量分析［｀19-20］。

鑒于此，建立了一種基于紫外可見分光光度法測(cè)定植物葉片中甲醛脫氫酶活性的評(píng)價(jià)方法，經(jīng)教學(xué)實(shí)踐表明，應(yīng)用于化學(xué)專業(yè)高年級(jí)本科生實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，可取得良好的教學(xué)效果。此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于高年級(jí)本科生，具有可行性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、多層次、開放式、研究型創(chuàng)新的特點(diǎn)，同時(shí)兼具方案可部分自主性設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容切合社會(huì)熱點(diǎn)問題、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，有效地激發(fā)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)積極性和主動(dòng)性。

2 實(shí)驗(yàn)原理

甲醛是一種室內(nèi)空氣中常見的污染物，具有強(qiáng)致癌性。綠色植物能有效凈化室內(nèi)空氣中的甲醛，因此在改善室內(nèi)空氣質(zhì)量方面得到了廣泛應(yīng)用［21-22］。蛋白質(zhì)在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等作用下會(huì)發(fā)生變性。甲醛脫氫酶的化學(xué)本質(zhì)是二聚體蛋白質(zhì)，在高溫時(shí)甲醛脫氫酶易失去活性。因此，本實(shí)驗(yàn)利用酶的熱不穩(wěn)定特點(diǎn)，采用高溫處理的方式制備失活提取液，消除新鮮提取液中甲醛脫氫酶的活性；通過在不同提取液中外加甲醛溶液，檢驗(yàn)一定時(shí)間后甲醛含量變化的方式來間接估測(cè)植物中有效成份對(duì)外加甲醛的凈化能力；根據(jù)新鮮提取液和失活提取液對(duì)外加甲醛凈化能力間的差異，評(píng)價(jià)植物葉中甲醛脫氫酶的活性大小。

溶液中甲醛濃度的測(cè)定，參照中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)HJ601-2011，采用乙酰丙酮分光光度法。基本原理為：甲醛在乙酸-乙酸銨緩沖溶液中與乙酰丙酮反應(yīng)，生成穩(wěn)定的黃色化合物，其用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)在414 nm 附近［23-25］。化學(xué)反應(yīng)式為：

3 主要試劑及儀器

3.1 主要試劑

（1）乙酰丙酮溶液。將125.000 g 乙酸銨、15.00 mL冰乙酸及1.25 mL乙酰丙酮試劑攪拌、溶解后定容于250.00 mL容量瓶中。

（2）甲醛使用液。取0. 70 mL 甲醛（含甲醛37% ～40%）定容到250 mL容量瓶中，用已知準(zhǔn)確濃度的硫代硫酸鈉溶液，標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。取上述標(biāo)定溶液25.00 mL稀釋、定容至100 mL容量瓶中待用。

（3）磷酸鹽緩沖液。稱取磷酸二氫鈉3.120 g 蒸餾水定容至100 mL 容量瓶，磷酸氫二鈉35.900 g 定容至500 mL 容量瓶，混合后用酸度計(jì)調(diào)節(jié)pH 至7.80。

3.2 主要儀器

TDL-50 電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇儀器廠）；HH-WL恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；BSA224S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；Eppendorf微量移液器：10 ～100 μL 和200 ～1 000 μL（北京華威中儀科技有限公司）；T6 新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 植物樣品的采集和前處理

實(shí)驗(yàn)所需的植物葉片樣品均由學(xué)生在校內(nèi)草坪、花園、荒地及校外公園空氣清新、土壤無污染歷史處采集，新鮮樣品經(jīng)冰盒保鮮短途運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室后，立即用預(yù)冷的自來水和蒸餾水清洗表面、拭干、準(zhǔn)確稱量處理好的植物樣品2.000 g，將瓷研缽置于冰盒上，分4 次加入40.00 mL在0 ～4 ℃預(yù)冷12 h的磷酸鹽緩沖液，快速研磨以提取出新鮮植物葉片中的有效成份，每次分離出的新鮮提取液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的50.00 mL 離心管中，混勻后在0 ～4 ℃條件下離心10 min，將上清液分成兩份，一份立即進(jìn)行新鮮提取液凈化外加甲醛實(shí)驗(yàn)，另一份置于試管中放入100 ℃沸水中加熱10 min，取出后冷卻離心，然后進(jìn)行失活提取液凈化外加甲醛實(shí)驗(yàn)。

4.2 校準(zhǔn)曲線的繪制

取6 支具塞玻璃試管，分別加入0、41.67、71.43、93.75、111.11、138.89 μg／mL 甲醛使用液，然后在上述比色管中分別加入1.00 mL乙酰丙酮溶液，定容至10.00 mL，搖勻后，放置于60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻、過濾、稀釋，在波長(zhǎng)414 nm 處，以水為參比測(cè)定其吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，試管中甲醛濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1 所示，曲線方程y ＝0.011 1x-0.063 6，相關(guān)系數(shù)R2＝0.990 4。

圖1 吸光度與甲醛濃度相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.3 外加甲醛凈化實(shí)驗(yàn)

在12 個(gè)具塞玻璃試管中分別加入1.00 mL 離心后的新鮮或失活植物提取液，分別加入0、41. 67、71.43、93.75 μg／mL 的甲醛使用溶液（每個(gè)濃度做3次），再分別加入1.00 mL 乙酰丙酮，蒸餾水定容至10.00 mL，搖勻，置于60 ℃水浴中加熱15 min 后，冷卻、過濾、稀釋后，在波長(zhǎng)414 nm處，以水為參比，測(cè)定濾出液的吸光度值。每位學(xué)生任選兩種植物樣品，完成外加甲醛凈化實(shí)驗(yàn)。

4.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

4.4.1 數(shù)據(jù)計(jì)算與處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定出凈化實(shí)驗(yàn)中不同條件下植物提取液（新鮮或失活）對(duì)外加甲醛的凈化能力；進(jìn)而根據(jù)植物樣品質(zhì)量和提取液體積，計(jì)算出不同條件下單位質(zhì)量植物葉對(duì)外加甲醛的凈化量，單位為μg／kg FW（鮮重）；依據(jù)同種植物新鮮提取液與失活提取液間凈化量的差值（ΔK），ΔK 值與甲醛脫氫酶活性呈正相關(guān)，判斷出植物葉中甲醛脫氫酶活性大小。

4.4.2 結(jié)果分析

依據(jù)13 個(gè)本科生分別測(cè)定的4 種植物提取液中甲醛脫氫酶活性大小的數(shù)據(jù)作圖（見圖2），由圖可見，不同學(xué)生測(cè)定的同種植物提取液中甲醛脫氫酶活性大小具有相同的規(guī)律，三葉草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；鵝腸草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，出現(xiàn)先增長(zhǎng)后降低最后持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)；灰灰草提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，與三葉草呈現(xiàn)相同趨勢(shì)；蜀葵提取液中甲醛脫氫酶活性隨著甲醛濃度的升高，逐漸降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“紫外分光光度法測(cè)定植物葉片中甲醛脫氫酶活性”的本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有良好的重現(xiàn)性。

圖2 4種植物提取液中甲醛脫氫酶去除甲醛量

5 結(jié) 語

在實(shí)踐中培養(yǎng)本科生的創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力，是高等教育日益發(fā)展進(jìn)步所必需的。本文所選的實(shí)驗(yàn)教學(xué)課題，以學(xué)生們熟悉并關(guān)心的空氣中甲醛污染及其植物凈化為導(dǎo)向和切入點(diǎn)，基于基礎(chǔ)教學(xué)中普遍學(xué)習(xí)的紫外可見分光光度計(jì)的使用，已成功地將“紫外光度法測(cè)定植物葉中甲醛脫氫酶活性”的綜合性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于化學(xué)專業(yè)本科高年級(jí)學(xué)生的實(shí)踐教學(xué)中，一方面有效地調(diào)動(dòng)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)的積極性和主動(dòng)性，另一方面進(jìn)一步加深了學(xué)生對(duì)紫外可見分光光度計(jì)理論知識(shí)和實(shí)際應(yīng)用的理解；通過明確的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)教學(xué)中對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路、意義、原理以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的論述，達(dá)到在強(qiáng)化技能性基本操作實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的同時(shí)，提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題能力的教學(xué)目的；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容具有學(xué)科交叉的特色，既突出了化學(xué)專業(yè)的特色，也適用于環(huán)境科學(xué)與工程及生物科學(xué)技術(shù)等相關(guān)專業(yè)的高年級(jí)本科生課堂教學(xué)。