探究式實驗教學設計和探討：猜猜它是誰？
——3T3-L1 和L929 細胞的增殖測定

潘 倩

（四川大學華西基礎醫學與法醫學院，成都610041）

0 引 言

細胞培養是包括醫學在內的生命科學領域最重要、最基礎的實驗技術之一，它在生命科學領域的應用十分廣泛，是學生今后從事專業相關工作所必須掌握的一門實驗技能［1］。在細胞培養的實驗教學中，如何吸引學生的興趣、激發學生求知的欲望，使其在短時間內掌握相關操作等這些問題給實驗教師提出了很大的挑戰［2］。為此，在探究式學習的理論基礎上，利用3T3-L1 和L929 兩種細胞在不同培養條件下增殖水平的差異，設計了“猜猜它是誰？——3T3-L1 和L929 細胞的增殖測定”這一綜合性與研究性實驗，以期激發學生的學習主動性和積極性，鍛煉學生的科研思維［3］，使其牢固掌握相關實驗技能，切實提高學習效果和實驗教學水平［4］。

1 教學設計

1.1 情境設計

①創設情境。老師告知學生現在實驗室有2 種連續細胞株，3T3-L1（小鼠脂肪前體細胞）和L929（小鼠結締組織成纖維細胞），但由于在細胞凍存時只對兩種細胞標記了A、B，并未寫具體名稱，已不能確認A和B具體是哪種細胞。②給出線索（見表1）。③啟發思考。老師提出問題，請大家根據已知線索，設計不同的培養條件，通過對A、B 兩種細胞的增殖測定，猜猜它是誰？

表1 3T3-L1 細胞和L929 細胞的說明

1.2 教學目的

通過此實驗的學習，使學生①了解體外培養環境中成纖維樣細胞和上皮樣細胞的形態特征；②熟悉細胞凍存與復蘇的操作方法；③掌握無菌技術；④掌握細胞傳代技術；⑤掌握倒置顯微鏡觀察體外培養細胞的使用方法；⑥了解細胞計數方法；⑦掌握臺盼藍拒染法計數活細胞；⑧了解細胞增殖測定方法；⑨掌握MTT法檢測細胞增殖［5-6］。

1.3 教學重點與難點

該探究式實驗教學項目的教學重點是無菌技術、細胞傳代技術、倒置顯微鏡的使用、臺盼藍拒染法計數活細胞、MTT法檢測細胞增殖。教學難點是學生要根據已知線索，自行設計實驗方案，通過對實驗結果的分析得出結論，這增加了實驗的趣味性和探索性。

1.4 教學安排

該探究式實驗教學項目的教學內容與學時安排見表2［7］，共計15 學時，分3 次進行，其中第1 次與第2次的時間間隔不低于24 h，“細胞增殖測定”實際操作只需2 學時，其余6 學時為細胞孵育和甲臜結晶溶解所需時間，不同高校可根據各自的教學要求對學時做適當調整。可根據細胞培養室的實際使用面積將學生分組，建議2 或3 人為1 小組，小組內成員協調分工與合作，共同完成實驗任務［8］。

表2 教學內容與學時安排

1.5 考核評價

充分貫徹全過程考核和非標準答案考試，成績構成［9］見表3，其中實驗操作和實驗方案與結果的匯報作為平時成績占總成績的80%；實驗報告是在所有實驗完成后，將3 次實驗的內容整合形成1 篇綜合性實驗報告。

2 教學內容

2.1 實驗材料與儀器設備

所需實驗材料有：3T3-L1 細胞和L929 細胞（中國科學院昆明細胞庫），Dhanks（無鈣鎂離子，Solarbio），胰蛋白酶溶液（0.25%，Hyclone），DMEM 培養液（高糖，Gibco），新生牛血清（new-born bovine serum，NBCS，Gibco），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，中喬新舟），臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒（碧云天），MTT細胞增殖檢測試劑盒（碧云天），96 孔細胞培養板，不同規格的槍頭、離心管等。所需儀器設備有：超凈工作臺，CO2培養箱，恒溫水浴鍋，移液器，血細胞計數板，離心機，倒置顯微鏡，酶標儀等。

2.2 實驗步驟

（1）細胞傳代。打開超凈工作臺紫外燈，滅菌30 min，然后關閉紫外燈，打開超凈工作臺鼓風機；在恒溫水浴鍋中37 ℃預熱DHanks液、胰蛋白酶溶液、DMEM培養液。在無菌超凈工作臺中，嚴格無菌操作，首先配制完全培養液，如90% DMEM ＋10% NBCS、90%DMEM ＋10%FBS；然后分別將A、B 兩種細胞的培養液去除，加入適量DHanks 液，清洗2 次；接著將DHanks液棄去后，加入適量胰蛋白酶，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若大部分細胞變圓，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加適量完全培養液終止消化。吸取培養瓶內的液體沖洗貼壁細胞，得到細胞懸液，輕輕混勻后取適量進行活細胞計數。

（2）活細胞計數。吸取50 μL細胞懸液，加入50 μL臺盼藍染色液（2 ×），輕輕混勻，染色3 min（不宜超過10 min）。取細胞計數板，在計數區蓋上一塊邊緣經輕輕潤濕的蓋玻片，將經染色的細胞混勻，吸取20 μL滴加在蓋玻片邊緣，使細胞懸液通過毛細管作用充滿蓋片和計數板之間，去除多余液體（不要吸走蓋玻片下方的液體），將計數板置于顯微鏡下，在10 ×物鏡下采用“計上不計下，計左不計右”的原則計數中央大方格內未被染色的活細胞，計數重復2 次，然后計算活細胞密度：活細胞密度（個／mL）＝未被染色的平均細胞數×104［10］。

（3）不同條件下的細胞接種培養。按自行設計的細胞培養方案將計數后剩余的細胞懸液平分，離心（1 000 r／min，5 min），去除上清，分別加入適量不同的完全培養液，混勻后分別向96 孔培養板中每孔加入約5 000 個活細胞，隨后加入相應的完全培養液至100 μL。每種培養條件設5 個復孔，隨后放入37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。

表3 考核評價表

（4）細胞觀察。打開電源，將燈光強度從最低開始調至合適強度，將培養板放置在倒置顯微鏡載物臺上，左右移動載物臺使光源對準待觀察細胞，選擇合適倍數物鏡（一般由低倍到高倍），雙眼從目鏡中觀察，轉動調焦旋鈕至細胞清晰。

（5）細胞增殖測定。向每個培養孔內加入10 μL MTT溶液（5 mg／mL），在CO2培養箱內繼續孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan 溶解液，適當混勻，在CO2培養箱內再繼續孵育，直至在普通光學顯微鏡下觀察發現紫色結晶即甲臜全部溶解（溶解時間與結晶量有關，一般為3 ～4 h）。隨后用酶標儀在檢測波長（570 nm）和校正波長（630 nm）下測定各孔吸光度。

（6）統計學分析。采用SPSS 19 軟件進行統計學分析，所有數據均用ˉx ±s 表示，組間比較采用單因素方差分析［11］。P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 實驗結果與分析

3.1 不同培養條件下3T3-L1 細胞和L929 細胞的增殖

在相同細胞接種量的情況下，接種3 d 后3T3-L1和L929 兩種細胞在不同培養條件下的OD 值（OD570-OD空白對照570平均值-OD630＋ OD空白對照630平均值）如表4 所示。其中3T3-L1 細胞在DMEM ＋10%NBCS和DMEM ＋10%FBS培養條件下的OD值有統計學差異（P ＜0. 05），L929 細胞在DMEM ＋10% NBCS 和DMEM ＋10%FBS 培養條件下的OD 值無明顯差異。在此實驗基礎上可推斷A、B各為哪種細胞。

表4 接種3d后3T3-L1 和L929 兩種細胞在不同培養條件下的OD值

3.2 實驗注意事項

（1）活細胞計數時，蓋玻片的邊緣要蓋住計數板最外邊的凹槽。蓋玻片和計數板之間應呈現牛頓環，這樣蓋玻片才算平整地蓋到計數板上，計數小室的深度僅為1 mm。往計數小室注入的細胞懸液不要太多，也不要太少，否則由于表面張力的變化會改變小室的容積，細胞懸液流到凹槽邊緣即可［10］。

（2）MTT法檢測細胞增殖時，終止培養時細胞數量不應過多，以防影響甲臜產生的量與細胞數量間的良好線性關系（OD 值在0.2 ～0.8 之間誤差較小）。MTT法檢測細胞增殖，每次實驗均應設置與實驗孔平行的空白對照，即除了不含細胞外其他條件相同的對照孔，最后比色時以對照孔調零。由于使用96 孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發的問題，一方面，由于96 孔板周圍1 圈最容易蒸發，可以采取棄用周圍1 圈的辦法，改加平衡鹽溶液、水或培養液；另一方面，可以把96 孔板置于靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。

4 實驗教學探討

4.1 開設探究性實驗教學項目的意義

細胞的增殖測定是具有普適性的細胞培養核心操作，培養學生掌握此實驗操作十分必要。傳統的實驗教學，一般采取“老師現場演示講解，學生依照教材摸索操作”的模式［12］，其教學效果往往不盡人意，究其原因，大多在于對學生學習主體地位的漠然以及對學生自主學習能力培養的忽視［13］。這就導致學生在習慣被動接受老師知識的情況下進入實驗室，操作停留在對老師現場演示講解的機械模仿、對實驗教材的盲目迷信階段，學生缺乏主動獲取知識的意識與能力，這顯然不利于他們掌握實驗技能、鍛煉能力素質。該探究式教學實驗項目，注重學生在學習過程中的主體地位，在圍繞知識點所創設的特定情境之下，通過老師的啟發、引導與支持，學生帶著問題開展自主性學習［14-16］，從而達到對知識技能的深入理解與掌握，對綜合素質的切實鍛煉與提高。

4.2 實驗項目的特色

該教學實驗項目，將探究式教學方法應用于細胞的增殖測定，教學活動的主體由老師轉移到學生，圍繞學生的自主知識構建，綜合運用主動學習、合作學習、探究式學習、基于問題的學習等多項教學策略，充分調動學生的學習積極性和主動性，通過培養學生的專業技能和綜合能力，促進學生的優質學習和全面發展。

4.3 實驗安排的可行性

該探究式實驗項目制定了詳細的操作流程，并經過實驗老師反復驗證，實驗結果重復性高。實驗中使用的3T3-L1 細胞和L929 細胞為常見細胞株，價格低廉，且易于培養。涉及的實驗技術有：無菌技術、細胞傳代技術、倒置顯微鏡的使用、臺盼藍拒染法計數活細胞、MTT 法檢測細胞增殖等細胞培養實驗，一般高校均開設有相關的細胞培養實驗課程，可操作性強。

4.4 實驗的推廣與應用

能否順利開展此實驗項目，首先要求實驗室具備3T3-L1 細胞和L929 細胞，也可參考此文思路，利用已有的細胞株自行設計相關探究式教學實驗項目。其次實驗室需具備細胞培養常規的儀器設備，其中若實驗室未配備酶標儀，可根據現有的實驗設備，修改教學安排，如改用直接計數法檢測細胞增殖。最后特別要求實驗老師在熟練掌握相關實驗技術的同時，能夠有效地啟發、引導與支持學生的探究式學習。因此，該探究式教學實驗項目可在具備以上條件的高校參考試行。

5 結 語

該教學實驗，改變了傳統實驗教學中學生被動消極的學習狀態，使學生以主動積極的姿態成為學習的主體；而老師則由指導變為引導，由講授變為啟發，并起總結深化的作用。這有效解決了傳統實驗教學存在的諸多問題，變革了傳統的實驗教學模式，是改進實驗教學的一次全新探索。