銀杏幼莖節無菌接種體系的建立

喻娜 趙有薇 潘阿且

摘要 [目的]建立以銀杏幼莖節為外植體的無菌接種體系。[方法]以銀杏樹當年生幼莖節為外植體，研究不同種類、不同濃度消毒劑、不同處理時間對外植體的消毒效果，及不同生長調節劑條件對愈傷的誘導。 [結果]外植體最佳接種條件為用75%乙醇處理2 min后，10%次氯酸鈉處理15 min，12%次氯酸鈉處理10 min;0.8%新潔爾滅處理20 min;12%雙氧水處理8～10 min，污染率和褐化率都相對較低。在0.3 ?mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA組合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合中，銀杏幼莖節的愈傷誘導率較高，愈傷的生長情況較好。[結論]該研究建立了以銀杏幼莖節為外植體的再生體系，為其愈傷誘導及其進一步的生理研究提供了基礎。

關鍵詞 幼莖節;無菌接種;愈傷誘導

中圖分類號 S723.1 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）19-0116-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.030

Abstract [Objective]To establish the tissue culture regeneration system of young stem nodes of Ginkgo biloba. [Method]Taking young stem nodes of annual G.biloba tree as explants，disinfection effect of different kinds，concentrations of disinfectants，treatment time on external implants，and different hormone conditions on callus induction were studied. [Result]The optimal inoculation conditions for explants were： after 75% alcohol treatment for 2 min，10% sodium hypochlorite treatment for 15 ?min and 12% sodium hypochlorite treatment for 10 min;0.8% bromogera mine for 20 ?min;12% hydrogen peroxide for 8-10 min; resulted in relatively low pollution rate and browning rate. In the hormone combination of 0.3 mol/L NAA and 0.3 mol/L 6-BA，0.3 mol/L NAA and 0.5 mol/L 6-BA，the callus induction rate of young stem nodes of G.biloba was higher and the callus growth was better. [Conclusion]This study established tissue culture regeneration system of G.biloba，which provided basis for its callus induction and further physiological studies.

Key words Young stem node;Aseptic inoculation;Callus induction

基金項目 廣安職業技術學院校級重點科研項目（GAZYKY-2019A03）;四川省教育廳重點科研項目（18ZA0228）。

作者簡介 喻娜（1986—），女，四川隆昌人，講師，碩士，從事植物組織培養研究和教學工作。

收稿日期 2020-03-04

銀杏（Ginkgo biloba L.）是銀杏科、銀杏屬落葉喬木，因古老而稀少被譽為“活化石”[1]，又因其集觀賞、食用、藥用、生態環保于一體而受到人們的關注[2]。銀杏傳統的育苗方法為實生繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等。但這些方法的繁殖率低、周期長，遠不能滿足市場的需求。如果想短期內得到大面積優良的銀杏苗，組織培養技術是一種可行有效的方式。傳統育種方式弊端的顯現促使銀杏的組織培養方面研究取得了一定進展，從不同外植體包括胚、莖段、子葉、胚軸、小孢子、配子體等方面都有相關研究[3]。總的來看，銀杏組培最易成功的外植體首屬莖段，莖段主要通過幼苗或者胚誘導的組培苗采集，幼莖的組培通過腋芽或嫩梢繁殖。羅紫娟[4]曾對銀杏胚和莖段進行過組織培養，獲得再生植株。羅言云等[5]用銀杏無菌苗帶腋芽的莖段為外植體，由帶腋芽的莖段分化芽，分化出的芽再在培養基上分化根，并形成試管苗。通過組培的方式可以保持銀杏母本的優良性狀，但分化率小，不定芽數較少，繁殖速度較慢。陳穎等[6]以銀杏成熟胚培養出的一個月月齡無菌幼苗各部位莖段為外植體，研究其頂芽、帶腋芽的中段、帶子葉的下段腋芽萌發和不定芽的分化情況時發現由胚誘導的組培苗莖段發生叢生芽的潛力最大。

以幼莖為外植體的研究多以0.1%升汞搭配75%乙醇進行消毒處理，幾乎沒有系統性地研究不同消毒劑對幼莖消毒的影響[7-9]。用于外植體滅菌的消毒劑種類很多，在實際應用中，外植體的消毒效果受消毒劑種類、濃度和處理時間及使用方法等多種因素的影響[10]。外植體的消毒效果直接影響銀杏莖節愈傷組織誘導、叢生芽誘導等，系統性地對銀杏幼莖節消毒效果研究為銀杏組織培養奠定了基礎。在植物組織培養過程中，6-BA、NAA、IBA等植物生長調節劑配比對多種植物的不同外植體愈傷誘導效果較好[11-13]，胡選萍等[14]在研究銀杏幼莖、莖尖為外植體時萘乙酸、6-芐基腺嘌呤都有利于愈傷的誘導。該研究選擇不同配比植物調節劑6-BA、NAA來研究銀杏幼莖節愈傷的誘導，以期為銀杏組培快繁及再生等生理學研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 采集3月下旬—5月下旬生長狀態基本一致、粗約2 mm的銀杏母樹當年生嫩枝莖節為外植體，切成小段，每段長約1.5 cm，中上段帶腋芽。

1.2 滅菌方法

剪取生長狀態基本一致的銀杏當年生枝條幼莖，連帶莖段的長度約0.5 cm，放入含洗衣粉的三角瓶中充分搖晃，靜止浸泡15 min，后在流水下沖洗30 min。在超凈工作臺上將沖洗干凈的幼莖節放入75%乙醇中充分搖晃2 min，無菌水沖洗3遍;然后根據預試驗分別放入不同濃度的消毒劑中處理不同時間：10%次氯酸鈉分別處理10、15、20 min，12%次氯酸鈉分別處理9、12、15 min ，15%次氯酸鈉分別處理8、10、12 min;新潔爾滅（0.5%、0.8%、1.0%）分別處理10、15、20 min;5%的雙氧水分別處理10、13、15 min，10%的雙氧水分別處理8、10、12 min，12%的雙氧水分別處理5、8、10 min。無菌水沖洗3遍，使用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養基上，每瓶接種7個莖節，每組重復3瓶，即每組接種21個。

1.3 愈傷誘導

選取經預培養后無菌的外植體，放置在含有不同濃度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的NAA和不同濃度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的6-BA組合的MS培養基中，對外植體進行愈傷誘導，每瓶接種3個外植體，每組重復3瓶，即每組接種9個。

1.4 培養條件

以MS培養基為基礎培養基，蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，pH調節為6左右，將滅菌好的幼莖節下端插入培養基中，暗培養1 d，然后置于光照強度1 000 lx、光照時間為12 h/d、溫度為25 ℃、濕度為50%左右的條件下培養。

1.5 指標測定

外植體的消毒效果主要通過污染率和褐化率來體現，該研究接種5 d后統計幼莖節的污染率和褐化率，污染率=污染的外植體個數/接種的外植體個數×100%，褐化率=褐化的外植體個數/接種的外植體個數×100%，并觀察幼莖節的生長情況。外植體的愈傷誘導情況主要由愈傷誘導率及愈傷的生長情況來體現，接種到愈傷培養基上30 d后統計愈傷誘導率，愈傷誘導率=產生愈傷的外植體個數/接種的外植體個數×100%，并觀察愈傷生長情況。

1.6 數據處理 采用DPS 7.05進行Duncans新復極差法分析。

2 結果與分析

2.1 次氯酸鈉消毒效果分析 不同濃度次氯酸鈉處理不同時間對外植體污染率和褐化率的影響存在差異（表1），第2組10%次氯酸鈉處理15 min的污染率和褐化率都與第1組差異極顯著（P<0.01），生長較好。12%的次氯酸鈉處理12 min 時的污染率和褐化率都最低，褐化率與第1組和第9組時差異極顯著（P<0.01），污染率與第1、4、6、7組時的差異顯著（P<0.05），但整體相對來說比10%的次氯酸鈉更容易褐化。15%次氯酸鈉處理12 min時污染率也低，但褐化率相對高。選用次氯酸鈉作為表面消毒劑時濃度在10%更利于外植體滅菌和生長。

2.2 新潔爾滅消毒效果分析

不同濃度新潔爾滅處理不同時間對外植體污染率和褐化率的影響存在差異（表2），整體來看低濃度的新潔爾滅有助于降低褐化率，但滅菌效果不理想，污染率最低是第6組，此條件下的褐化率也較低。選用新潔爾滅作消毒劑時用濃度0.8%處理20 min較合適。

2.3 雙氧水消毒效果分析

不同濃度雙氧水處理不同時間，第8、9組污染率最低，與其他幾組差異顯著（P<0.05），12%雙氧水處理8、10 min污染率和褐化率相對較低，外植體生長較好。選用雙氧水作銀杏幼莖節消毒劑時用12%雙氧水處理8～10 min為宜（表3）。

2.4 銀杏幼莖愈傷誘導試驗結果

對外植體進行愈傷誘導試驗，選用不同濃度的NAA和6-BA組合（表4），發現低濃度和高濃度生長調節劑都不利于愈傷的誘導，第1組和第2組未誘導出愈傷，第9組的愈傷較疏松，呈黃色，生長較緩慢;第3～8組愈傷誘導率都比較高，愈傷生長狀態都比較好，第6組、7組和8組愈傷誘導率較高，較緊密，顏色呈黃綠色;第4組、5組愈傷緊密，呈綠色，更有利于芽的誘導（圖1）。從數據分析看，NAA對愈傷的誘導要比6-BA的影響大，從該試驗可以看出，0.3 mol/L NAA比0.1、0.5 mol/L的NAA誘導愈傷效果好一些。綜合2種生長調節劑的影響，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA的組合、0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合下銀杏幼莖節的愈傷誘導效果相對較好。

3 結論

采集3月下旬到5月下旬生長狀態基本一致、粗約2 mm的銀杏母樹當年生嫩枝莖節為外植體，切成每段長約1.5 cm，通過預處理后采用75%乙醇處理2 min，再用10%次氯酸鈉處理15 min，12%次氯酸鈉處理10 min或0.8%新潔爾滅處理20 min或12%雙氧水處理8～10 min，處理效果較好。3種消毒劑中次氯酸鈉控制污染率的效果最好，雙氧水控制褐化率的效果最好，可采用75%乙醇處理2 min，12%雙氧水處理8～10 min。在誘導愈傷組織的過程中，NAA較6-BA對愈傷誘導的效果影響更大，其中濃度為0.3 mol/L的NAA誘導愈傷的效果更好，2種生長調節劑結合使用時，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA組合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合下銀杏幼莖節的愈傷誘導率較高，愈傷生長情況較好，更有利于芽再生。

參考文獻

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