木瓜蛋白酶分離蛋殼殼膜研究

摘要 介紹了利用木瓜蛋白酶酶解分離蛋殼殼膜的方法，探討了木瓜蛋白酶酶解分離殼膜的最佳反應條件。結果表明，木瓜蛋白酶酶解分離殼膜的最佳反應條件如下：蛋殼粉用量為50 g，木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰，反應時間為90 min，反應溫度為60 ℃，反應體系pH為5.5，反應體系固液比為1∶8。在此最佳反應條件下，回收殼下膜的平均重量為1.65 g。

關鍵詞 木瓜蛋白酶;分離;殼膜

中圖分類號 TS253.9 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）19-0186-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.049

Abstract This paper introduced the method of separating shell membrane by enzymatic hydrolysis of papain. The optimal reaction conditions for the separation of shell membrane by enzymatic hydrolysis of papain were as follows： eggshell powder dosage of 50 g， the proportion of papain dosage in eggshell powder dosage of 2.5‰， the reaction time of 90 min， the reaction temperature of 60 ℃， pH of the reaction system of 5.5， solidliquid ratio of 1∶8. Under the optimal reaction conditions， the average weight of the undershell membrane recovered 1.65 g.

Key words Papain;Separation;Eggshell membrane

基金項目 衡陽市科學技術發展計劃項目（2015KS26）;湖南環境生物職業技術學院支柱工程資助項目。

作者簡介 李逢振（1983—），男，湖南衡陽人，副教授，碩士，從事畜產品加工和畜禽廢棄物綜合利用研究。

收稿日期 2020-03-25

隨著人們生活水平的不斷提高，雞蛋已成為居民餐桌上必不可少的動物性食品。蛋殼是雞蛋的重要組成部分，其主要由石灰質真殼和殼下膜2個部分組成[1]，石灰質真殼中的碳酸鈣可以用于轉化制備乳酸鈣[1]、乙酸鈣[2]等生物有機鈣產品。從殼下膜中可以轉化提取出抗氧化多肽[3]、透明質酸[4]、硫酸軟骨素[5]等可溶性高分子化合物，這些物質可用于制備生物吸附劑[6]、酶生物傳感器固定化膜[7]、生物礦化調控基質[8]、新型藥物控釋材料及醫用包扎材料[9]、膠原蛋白護膚品[10]等產品，具有極高的利用價值。筆者選用木瓜蛋白酶對蛋殼進行生物酶解，使其殼膜分離，旨在為進一步研究利用石灰質真殼和殼下膜奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞蛋購于當地農貿市場;木瓜蛋白酶（食品級酶制劑，酶活200 000 U/g，南寧龐博）;鹽酸（分析純，國藥試劑）;氫氧化鈉（分析純，國藥試劑）。

1.2 主要儀器與設備

電熱恒溫干燥箱（型號202，上海科恒）;數顯恒溫水浴鍋（型號HHS，上海博迅）;粉碎機（型號QE-200，武義屹立）;電子分析天平（型號JJ224BC，常熟雙杰）;數顯酸度計（型號PHS-3C，上海越平）。

1.3 試驗原理

雞蛋的石灰質真殼部分與殼下膜主要通過糖蛋白微細纖維相連接，其主要是由蛋白質組成，因此可以使用木瓜蛋白酶在適當條件下對其進行生物酶解，將蛋白質轉化成多肽和氨基酸等物質，改變真殼乳頭層中的鈣纖維狀錐形體與殼下膜中角蛋白的結合狀態，降低石灰質真殼與殼下膜的結合力[11]，從而達到分離殼膜的目的。

1.4 試驗方法

1.4.1 雞蛋殼預處理階段。

將去除蛋黃和蛋清等可食部分的雞蛋殼置于清水中浸泡30 min，再用清水沖洗，去除雞蛋殼表面附著的雜質，洗凈后撈出。將瀝干水分的雞蛋殼放入70 ℃恒溫干燥箱中干燥3 h，待蛋殼冷卻后用粉碎機粉碎3 min，貯藏備用。

1.4.2 酶解反應階段。

取50 g蛋殼粉置于燒杯中，將調節好pH的純凈水按一定比例加入燒杯中，再加入木瓜蛋白酶攪拌5 min，將攪拌好的燒杯置于恒溫水浴鍋中，進行酶解反應。

1.4.3 干燥稱量階段。

待酶解反應完成后，去除上清液，再將燒杯置于電熱恒溫干燥箱中進行干燥，干燥完成后將上層蛋膜取出進行稱量。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶用量對回收殼下膜的影響

稱取50 g蛋殼粉置于燒杯中，備用;將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入不同用量的木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應120 min。稱量不同木瓜蛋白酶用量下酶解反應后回收的殼下膜重量，試驗結果如圖1所示。

從圖1可以看出，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，回收的殼下膜量逐漸增加，當酶用量達到2.5‰時回收的殼下膜量最多，隨后當酶用量繼續增加時，回收的殼下膜量呈現下降的趨勢，這是由于過量的酶與殼下膜在反應體系中繼續發生酶解反應，從而導致回收的殼下膜量減少。由此可見，當木瓜蛋白酶用量為蛋殼粉量的2.5‰時，可以取得較好的殼膜分離效果。

2.2 反應時間對回收殼下膜的影響

稱取50 g蛋殼粉置于燒杯中，備用;將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應不同時間。稱量不同反應時間的酶解反應后回收的殼下膜重量，結果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著反應時間的增加，回收的殼下膜量呈現先增加后減少的變化趨勢，當反應時間為90 min時回收的殼下膜量最多，此后隨著反應時間的繼續增加時，木瓜蛋白酶與殼下膜繼續發生酶解反應，導致殼下膜逐漸損耗。同時，隨著反應時間的延長導致反應消耗的能源逐漸增加。由此可見，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應90 min時可以取得較好的殼膜分離效果。

2.3 反應溫度對回收殼下膜的影響

稱取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后，再將燒杯放入不同溫度的恒溫水浴鍋中反應90 min。稱量不同反應溫度條件下酶解反應后回收的殼下膜重量，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，當反應溫度為45～60 ℃時，回收的殼下膜量逐漸增加，但總體變化不大，當反應溫度超過60 ℃后，回收的殼下膜量出現明顯的下降。這是因為高溫導致木瓜蛋白酶發生變性，使得木瓜蛋白酶的酶活力明顯減弱，從而影響了酶解反應的殼膜分離效果。由此可見，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應溫度保持在60 ℃時可以取得較好的殼膜分離效果。

2.4 反應體系pH對回收殼下膜的影響

稱取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將不同pH的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應90 min。稱量不同反應體系pH條件下酶解反應后回收的殼下膜重量，結果如圖4所示。

從圖4可以看出，木瓜蛋白酶在偏酸性和中性的環境中均能發揮較好的酶解效果，當反應體系pH為4.5～5.5時回收的殼下膜量最多，隨著反應體系的pH升高，回收的殼下膜量呈現下降的趨勢。這是因為反應體系的pH逐漸向木瓜蛋白酶的等電點8.75靠近，酶活性受到抑制，影響了殼膜分離效果。另外，反應體系的pH越低，反應產生的廢液對環境造成污染會更加嚴重，因此需要在試驗結果確定時進行綜合考量。由此可見，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應體系的pH控制在5.5時可以取得較好的殼膜分離效果。

2.5 反應體系固液比對回收殼下膜的影響

稱取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將pH 5.5的純凈水按不同的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應90 min。稱量不同固液比下酶解反應后回收的殼下膜重量，結果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著反應體系固液比的增加，回收的殼下膜量總體上呈現增加的趨勢，說明在液體環境下木瓜蛋白酶的活力得到有效激發，酶解反應順利進行。但是，當固液比達到1∶9時，回收的殼下膜量稍微有所減少，這是由于大量液體稀釋了木瓜蛋白酶的酶解效果。由此可見，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應體系的固液比為1∶8時可以取得較好的殼膜分離效果。

2.6 最佳反應條件的確定

通過以上單因素試驗確定最佳反應條件如下：蛋殼粉用量為50 g;木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰;反應時間為90 min;反應溫度為60 ℃;反應體系pH為5.5;反應體系固液比為1∶8。選用最佳反應條件進行3次平行試驗，確定最佳反應條件下回收的殼下膜重量，結果如表1所示。

由表1可知，在最佳反應條件下，采用木瓜蛋白酶進性殼膜分離能取得較好的效果，在蛋殼粉用量為50 g、木瓜蛋白酶用量為蛋殼粉量的2.5‰、反應時間為90 min、反應溫度為60 ℃、反應體系pH為5.5、反應體系固液比為1∶8的條件下回收殼下膜的平均重量為1.65 g。

3 結論與討論

研究發現，利用木瓜蛋白酶的酶解作用可使蛋殼真殼與殼下膜發生分離，其最佳反應條件如下：蛋殼粉用量為50 g;木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰;反應時間為90 min;反應溫度為60 ℃;反應體系pH為5.5;反應體系固液比為1∶8。在此條件下回收殼下膜的平均重量為1.65 g。經過殼膜分離可以獲取更加純凈的蛋殼真殼和殼下膜，為其后續的轉化利用奠定了基礎。

參考文獻

[1] 李逢振.蛋殼殼膜分離技術的研究[J].農產品加工，2020（4）：65-67.

[2] 劉敏，郭宇，武月，殷慧敏，等.食品補強劑醋酸鈣的制備工藝研究[J].天津化工，2017，31（4）：19-22.

[3] 李曉云. 基于雞蛋殼膜的三種生物敷料的制備及其傷口愈合功能研究[D].武漢：華中農業大學，2019.

[4] 朱文婷，吳士筠，楊惠，等.酶法提取雞蛋殼膜中透明質酸的工藝優化[J].食品科技，2016，41（1）：204-209.

[5] 劉濤，張鐵鵬，欒欣悅，等.響應面法優化蛋殼膜硫酸軟骨素提取工藝[J].包裝工程，2019，40（17）：48-55.

[6] TSAI W T，YANG J M，LAI C W，et al.Characterization and adsorption properties of egg shells and eggshell membrane[J].Bioresour Technol，2006，97（3）：488-493.

[7] ZHANG G M，LIU D S，SHUANG S M，et al.A homocystein biosensor with eggshell membrane as an enzyme immobilization platform[J].Sens Actuators B：Chem，2006，114（2）：936-942.

[8] DONG Q，SU H L，ZHANG D，et al.Biotemplatedirected assembly of porous SnO2 nanoparticler into tubular hierarchical structures[J].Scripta materialia，2006，55（9）：799-802.

[9] INO T，HATTORI M，YOSHIDA T，et al.Improved physical and biochemical features of a collagen membrane by conjugationg with soluble eggshell membrane protein[J].Biosci Biotechnol Biochem，2006，70（4）：865-873.

[10] 趙敏，陳訪訪，潘津泳，等.蛋殼膜中膠原蛋白的提取分離[J].食品研究與開發，2012，33（4）：17-19.

[11] 楊德玉，李珍，高新，等.酶法提取蛋殼膜中的角蛋白[J].食品科學，2007，28（6）：240-242.