鹽酸大觀霉素高效液相色譜檢測方法的建立

王麗霞 孟慶娟 李生龍

摘要 [目的]建立一種簡便快捷且穩定經濟的鹽酸大觀霉素高效液相色譜檢測方法。[方法]選用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈-四氫呋喃-水（35∶35∶30），檢測波長415 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL的高效液相色譜條件，研究該條件下檢測樣品含量的可行性，并與國家獸藥典中的抗生素微生物檢定法（管碟法）的檢測結果進行對比。[結果]鹽酸大觀霉素濃度在100 ～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系，回收率為99.6%，批內變異系數為0.55%，穩定性良好。同一樣品2種方法的檢測結果相對偏差為0.42%，符合有關規定。[結論]該試驗使用的高效液相色譜法（HPLC）較抗生素微生物檢定法操作簡便且準確度和穩定性更高。

關鍵詞 鹽酸大觀霉素;高效液相色譜法;含量測定;管碟法

中圖分類號 R927.2 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）19-0198-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.052

Abstract [Objective] To establish a simple， rapid， stable and economical high performance liquid chromatography method for the detection of spectinomycin hydrochloride.[Method] C18 chromatographic column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was selected; mobile phase： acetonitriletetrahydrofuranwater （35∶35∶30）， detection wavelength 415 nm， column temperature 30 ℃， flow rate 1 mL/min， and high performance liquid phase color 20 μL.The feasibility of measuring the sample content by this method was studied， and the results were compared with the test results of the antibiotic microorganism assay （cupplate method） in the National Veterinary Pharmacopoeia. [Result] The concentration of spectinomycin hydrochloride at 100-900 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area， the recovery rate was 99.6%， the intra batch variation coefficient was 0.55%， and the stability was good. The relative deviation of the results of the two methods of the same sample was 0.42%， which was in conformity with the relevant regulations. [Conclusion]The high performance liquid chromatography （HPLC） used in this experiment is simpler， more accurate and more stable than the antibiotic microbiological assay.

Key words Spectinomycin hydrochloride;High performance liquid chromatography;Content determination;Cupplate method

作者簡介 王麗霞（1982—），女，河北唐山人，獸醫師，碩士，從事獸醫藥理學與毒理學研究。

收稿日期 2020-07-14

大觀霉素（spectinomycin）又稱壯觀菌素，屬于氨基糖苷類抗生素，是美國科研機構于1960年從大觀鏈霉菌中提取得到的。由于大觀霉素對動物體的毒副作用較小且在動物體內殘留甚微，因此成為獸醫及養殖戶用藥的首選藥物之一。大觀霉素常以鹽酸鹽或硫酸鹽的形式被使用，兩者均為白色或者類白色的粉狀物，易溶于水，極微溶于乙醇。大觀霉素分子式為C14H25ClN2O7，分子量為368.810 5 Da。抗菌譜較廣，可用于治療大部分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的疾病，對支原體感染也有一定的治療效果。其中，大觀霉素對淋病奈瑟菌有高度的抗菌活性，對許多腸桿菌科細菌具有中度抗菌活性，而其對沙眼衣原體和梅毒螺旋體無活性。大觀霉素是通過與細菌核糖體30S亞單位結合，從而抑制細菌蛋白質的合成以發揮抗菌的作用[1]。

目前獸藥典載錄的大觀霉素的主要劑型有鹽酸大觀霉素注射液和鹽酸林可大觀霉素可溶性粉。鹽酸大觀霉素注射液常用于治療淋病奈瑟菌所致的前列腺炎、尿道炎、宮頸炎和直腸感染，其中治療對四環素和青霉素耐藥的菌株引起的感染效果更佳;鹽酸大觀林可霉素可溶性粉主要用于畜牧養殖業方面，用于治療和預防鴨疫巴氏桿菌、鴨霍亂、沙門氏菌和大腸桿菌等細菌性疾病。目前，國內畜牧業對于大觀霉素的需求量非常大，因此各科研機構在不斷地進行鹽酸大觀霉素臨床使用新劑型的研究，而大觀霉素的含量測定是中間必不可少的一個環節。大觀霉素具有極性強且無特征性紫外吸收基團的特點，紫外最大吸收波長在190 nm附近，屬于末端吸收區[2]，含量分析比較困難。目前已經研究出的大觀霉素含量測定方法有氣相色譜法[3-4]、高效液相色譜-串聯質譜法[5-6]、高效液相色譜-電化學檢測法[7-8]、高效液相色譜-蒸發光散射檢測法[9-10] 、薄層色譜法[11]、高效液相色譜熒光法[12]和國家獸藥典中的抗生素微生物檢定法[13]等。其中的一些方法對儀器要求很高，缺乏特異性。在用于企業對產品的質量監控時，太過耗費成本且過程繁復。因此，極需尋找操作簡便、實用經濟且檢測效果可信度高的方法。該試驗主要采用HPLC法對鹽酸大觀霉素含量進行測定，HPLC法的優勢在于檢測周期短、操作簡便快捷、經濟實用。而且在該試驗中會將HPLC法的試驗結果與國家獸藥典中的抗生素微生物檢定法（管碟法）的標準結果進行比較，以驗證HPLC法結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物。

肺炎克雷伯標準菌種[CMCC（B）46 117]，購于廣東環凱微生物科技有限公司;大觀霉素標準品，購于中國獸醫藥品監察所;鹽酸大觀霉素原料，購于浙江康恩貝集團。

1.1.2 主要化學試劑。

抗生素檢定培養基Ⅱ號（高pH），購于青島高科園海博生物技術有限公司;

營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基，購于杭州生物試劑有限公司;

磷酸二氫鉀，購于天津市凱通化學試劑有限公司;

2，4-二硝基苯肼、三氟乙酸、乙腈，購于國藥集團化學試劑有限公司;

四氫呋喃，購于宿州化學試劑廠;

丙酮，購于天津市致遠化學試劑有限公司;

無水葡萄糖，安徽華澳生物技術有限公司自購;

氫氧化鈉，購于上海潤捷化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器。

電熱恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）;

大容量電動移液器（上海泰坦科技股份有限公司）;

電子分析天平（美國梅特勒-托利多科學儀器有限公司）;

水浴鍋（常州市華普達儀器制造廠）;

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司，型號YX280B）;

電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;

多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅威鋒技術開發公司，型號ZY-300IV）;

數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ3200DB）;

高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 主要試劑配制

1.2.1 磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）。

稱定磷酸二氫鉀2.72 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液116.4 mL，用純水稀釋定容至400 mL。

1.2.2

細菌培養基。

稱定抗生素檢定培養基Ⅱ號（高pH）26.55 g，加熱攪拌溶解于900 mL蒸餾水中備用。

1.2.3

大觀霉素標準溶液。

精密稱定大觀霉素標準品37.99 mg，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）溶于25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度線;分別移取5 mL至50 mL（S2）和100 mL（S1）容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分別將其定容至容量瓶刻度線處。

1.2.4

鹽酸大觀霉素樣品溶液。

精密稱定鹽酸大觀霉素原料藥64.18 mg，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）溶于50 mL容量瓶中，并稀釋至刻度線;分別移取5 mL至50 mL（T2）和100 mL（T1）容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分別將其定容至容量瓶刻度線處。

1.2.5

流動相。

以乙腈∶四氫呋喃∶水（35∶35∶30）為流動相，按試驗實際需要量進行配制。

1.2.6

衍生試劑。

稱定三氟乙酸9.12 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度線。

稱定2，4-二硝基苯肼0.50 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度線。

1.2.7

大觀霉素標準溶液。

精密稱定大觀霉素標準品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度，現配現用。

1.3 抗生素微生物檢定法（管碟法）

1.3.1 滅菌。

1.3.1.1

高壓滅菌。培養皿、培養基、磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）、牛津杯等，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3.1.2

高溫滅菌。陶瓷瓦片、20 mL刻度吸管在烘箱中140 ℃干熱滅菌1 h。

1.3.1.3

紫外燈滅菌。微生物室、溫度計、移液器、大容量電動移液器、鋼管放置器等紫外燈滅菌30 min。

1.3.2 操作步驟。

①取肺炎克雷伯菌[CMCC（B）46 117]接種于營養瓊脂斜面上，在37 ℃培養20～22 h，然后將培養好的菌接種于營養肉湯中制備成菌液，保存備用。

②將36個培養皿放置在工作臺上，使用刻度吸管精密量取20 mL培養基于培養皿中，輕輕搖晃鋪平（不能有氣泡）。

③用1 mL移液器移取0.6 mL菌液于滅菌過的180 mL培養基中（培養基溫度50 ℃）。

④待培養基冷卻凝固后，再移取5 mL含有菌液的培養基鋪于其上，鋪平（不能有氣泡）。

⑤將牛津杯放入鋼管放置器，待培養基再次冷卻凝固后，將培養皿放置在鋼管放置器下放入牛津杯（4個）。

⑥向牛津杯中加入大觀霉素標準品溶液和大觀霉素樣品溶液，按標準順序每個牛津杯加入270 μL藥液。

⑦每個樣品做一個平行，每個平行做6個重復。

⑧蓋上陶瓷瓦片，放入電熱恒溫培養箱中，37 ℃下培養16～18 h。

⑨培養好后取出放入ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀進行效價分析。

1.4 高效液相色譜法

1.4.1 色譜條件。

色譜柱為安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈∶四氫呋喃∶水（35∶35∶30），柱溫30 ℃，檢測波長415 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

1.4.2 線性關系考察。

精密稱定大觀霉素標準品12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度。分別準確量取1、3、5、7、9 mL標準曲線儲備液于10 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻;各吸取0.5 mL于5 mL離心管中，分別加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，將其置于旋渦振蕩器上充分振蕩，然后置于恒溫水浴鍋中于70 ℃下進行衍生化反應60 min，衍生化反應結束后放置于冰水中，待冷卻后加入丙酮0.5 mL以終止反應，再次充分振蕩，繼續置于恒溫水浴鍋中于70 ℃下加熱10 min，取出后在室溫下自然冷卻，于11 000 r/min離心10 min，過膜后利用高效液相色譜進行檢測，以大觀霉素色譜峰面積與相應的藥物濃度繪制標準曲線，得出線性回歸方程。

1.4.3 回收率試驗。

以無水葡萄糖為空白輔料，分別向其中加入大觀霉素標準品，制成標示量80%、100%、120% 3個已知濃度樣品，按照“1.4.2”項下衍生方法對每個樣品進行處理，利用HPLC對其進行含量檢測，代入以下公式計算每個樣品的回收率，即回收率=實際百分含量/理論百分含量×100%。

1.4.4 精密度試驗。

按照標準曲線制備液的方法配制100、500和900 μg/mL 3種不同濃度的大觀霉素標準品溶液各3份，按照“1.4.2”項下衍生方法對每個樣品進行處理，利用HPLC對其進行含量檢測，每個樣品連續檢測3次，將試驗結果代入以下公式并計算3組樣品的批內變異系數，變異系數=（標準偏差/平均值）×100%。

1.4.5 穩定性試驗。

按照標準曲線制備液的方法配制300 μg/mL的大觀霉素標準品溶液，按照“1.4.2”項下衍生方法對樣品進行處理，過膜后利用HPLC對分別放置0、3、6 h的樣品溶液進行含量檢測，以峰面積計算大觀霉素的RSD。

1.4.6 雜質干擾試驗。

取空白原料藥（僅含輔料無水葡萄糖），按照“1.4.2”項下衍生方法對樣品進行處理，過膜后利用HPLC進行檢測，觀察在對照品出峰的相應時間內空白輔料有無峰面積。

1.4.7 含量測定。

精密稱定鹽酸大觀霉素原料12.50 mg于25 mL容量瓶中，用純水完全溶解，稀釋至刻度。分別準確移取0.5 mL待測大觀霉素標準溶液和鹽酸大觀霉素樣品溶液于5 mL離心管中，再分別加入2 mL三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液，將離心管置于旋渦振蕩器上充分振蕩，然后放置在70 ℃恒溫水浴鍋中進行衍生化反應60 min，結束后放置于冰水中，待其冷卻后加入丙酮0.5 mL以終止反應，充分振蕩，再置于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，取出后在室溫下自然冷卻，然后11 000 r/min離心10 min，過膜后利用HPLC進行檢測。

2 結果與分析

2.1 抗生素微生物檢定法（管碟法）檢測

抗生素微生物檢定法的檢測數據結果見表1，其中所使用的標準品效價為644.0 IU/mg。使用ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀讀數分析后，可知該鹽酸大觀霉素原料藥的效價為668.5 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.243 1%，偏離平行F3=3.842 6，P>0.05。同法平行試驗測得結果為該鹽酸大觀霉素原料藥的效價為672.7 IU/mg，其中平均可信限率FL=4.692 3%，偏離平行F3=1.840 8，P>0.05。

根據《中華人民共和國獸藥典》（2015年版第一部）要求，平均可信限率不得大于5%，偏離平行F3不得大于5，P應大于0.05。由表1可知，結果均符合規定，平均效價為670.6 IU/mg。

2.2 高效液相色譜檢測

2.2.1 線性關系考察。

將配制的5個不同濃度的大觀霉素標準品溶液進行高效液相色譜法檢測，其檢測結果見圖1。由圖1可知，鹽酸大觀霉素濃度在100～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=9.376 1x+122.15（R2=0.999 7）。

2.2.2 回收率試驗。

由表2可知，所配制的80%、100%和120% 3個已知濃度樣品的回收率分別是79.2%、99.0%、120.8%，經過計算可知其平均回收率為99.7%，表明該試驗大觀霉素檢測方法的回收率良好。

2.2.3 精密度試驗。由表3可知，100、500和900 μg/mL 3組不同濃度大觀霉素標準品溶液的批內變異系數分別為1.12%、0.42%和0.10%，平均批內變異系數為0.55%，表明該試驗的大觀霉素檢測方法精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗。由表4可知，在放置0、3和6 h檢測的大觀霉素標準品溶液以峰面積計算的RSD分別為0.33%、0.17%和0.21%，表明該試驗方法所處理的大觀霉素標準品溶液在6 h內檢測含量穩定。

2.2.5 雜質干擾試驗。

利用高效液相色譜檢測的鹽酸大觀霉素空白、大觀霉素標準品溶液與鹽酸大觀霉素供試品溶液的高效液相色譜圖見圖2～4。

通過對比標準品和供試品的出峰時間可知，供試品出峰時間和對照品出峰時間一致，由此定性說明此供試品是大觀霉素;通過觀察供試品和輔料空白圖譜可知，在供試品出峰時間內，空白輔料未檢測出峰面積，說明輔料對試驗結果無影響。

2.2.6 含量測定。

鹽酸大觀霉素原料藥經高效液相色譜法檢測分析后得其含量結果見表5。由表5可知，測量的3個平行樣品的檢測效價結果分別為676.8、676.0和676.2 IU/mg，其平均效價值為676.3 IU/mg，后經自動水分滴定儀檢測該原料藥的水分為16.3%，其含量按干燥品計算結果為808.0 IU/mg，而2015版獸藥典第一部規定鹽酸大觀霉素標準含量應大于779.0 IU/mg，由此可見該原料符合獸藥典規定，判定該批原料合格。

3 討論

3.1 管碟法的優缺點

抗生素微生物檢定法（管碟法）是我國獸藥典中鹽酸大觀霉素含量測定的標準方法。該方法主要是利用抗生素在瓊脂培養基中的擴散作用，來比較標準品溶液與供試品溶液二者對接種的試驗菌種的抑制作用，即表現在瓊脂培養基上抑菌圈的大小，以此來測定供試品的效價。管碟法的優點是特異性強、靈敏度高，但是也有明顯的不足：①整個操作過程繁瑣復雜，工作量大，測定周期長，且需要精確熟練的操作。②對于操作空間要求較高，操作前需要對微生物室、操作臺、試驗使用的器材設備等進行滅菌，確保試驗過程不被其他雜菌污染。③肺炎克雷伯氏菌是條件致病菌，試驗安全性低，且菌種的保存要求高，需傳代培養，制備的菌液容易在操作過程中被雜菌污染，需現配現用。④該方法測定的是總效價，無法區別主要成分和其他相關組分的含量，也不能確定雜質的有關信息，因此不能直觀地反映鹽酸大觀霉素的純度[2]。

3.2 高效液相色譜檢測法條件的選擇

由于大觀霉素沒有特征性紫外吸收光譜，所以該試驗采用了衍生化法。利用大觀霉素結構中的活潑基團與衍生試劑形成在紫外區有吸收的基團，以便于紫外檢測[1]。

該試驗選擇了乙腈-四氫呋喃-水（35∶35∶30）為流動相，此流動相比例能縮短出峰時間，并且雜峰分離清晰，互不干擾，便于鹽酸大觀霉素含量的檢測。

3.3 衍生試劑的選擇

該試驗選用了三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液和2，4-二硝基苯肼（DNPH）-乙腈溶液為衍生試劑，2，4-二硝基苯肼（DNPH）可與大觀霉素的羰基反應生成苯腙化合物2，4-二硝基苯肼（DNPH）-大觀霉素[14]，反應需在酸性條件下進行，三氟乙酸（TFA）即用于控制反應過程中的酸性條件[15]。文獻報道，三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的濃度有3%[16]和6%[14]，使用這2種濃度的三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液發現，經其處理后的大觀霉素標準品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液降解速度快，不利于檢測。而提高三氟乙酸（TFA）-乙腈溶液的濃度為9%[17]后，大觀霉素標準品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液不容易降解，并且穩定性至少可以維持6 h。

3.4 注意事項

抗生素微生物檢定法（管碟法）中應注意菌種菌液的保存及試驗器材的滅菌，而且要將高壓滅菌的器材放入烘箱中烘干，不能殘留水分;鋪培養皿時要邊鋪邊搖晃，使得瓊脂培養基鋪平、鋪滿且不能有氣泡;向培養基中加菌液時，要求培養基的溫度在50 ℃左右，以確保細菌的活性;使用移液器向牛津杯中注入大觀霉素標準品溶液和鹽酸大觀霉素供試品溶液時要注意掌握力度，緩慢注入，且每個牛津杯注入的量要保持一致，不能濺到牛津杯外。

高效液相色譜檢測法中，大觀霉素標準品溶液和鹽酸大觀霉素樣品溶液要同時配制同時衍生，配制完成標準品溶液和樣品溶液應放在避光處保存。

4 結論

該研究分別采用HPLC法和抗生素微生物檢定法（管碟法）對鹽酸大觀霉素含量進行測定，2種方法測得結果基本一致。HPLC法測得鹽酸大觀霉素濃度在100～900 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系，同時具有良好的回收率、精密度及穩定性，且該方法檢測周期短、操作簡便、準確性高，比管碟法更適用于企業對鹽酸大觀霉素原料及相關半成品和成品的質量監控。

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