木薯SCARECROW-LIKE（SCL）基因克隆、生物信息學及非生物脅迫下表達分析

樊鑄硼　羅興錄　單忠英　黃堂偉　程隆祥　吳美艷

摘要：【目的】克隆木薯SCARECROW-LIKE（MeSCL）基因，對其進行生物信息學分析，并檢測其在非生物脅迫下的表達情況，為深入研究木薯MeSCL基因響應非生物脅迫的調控機制提供理論參考。【方法】以木薯品種D346為材料，采用RT-PCR克隆MeSCL基因編碼區(qū)（CDS）序列，并利用生物信息學分析軟件進行序列特征分析，采用實時熒光定量PCR檢測其在干旱、鹽、氧化和低溫脅迫下木薯葉片中的表達情況。【結果】克隆獲得的MeSCL基因編碼區(qū)（CDS）序列全長1655 bp，與參考序列（GenBank登錄號LOC110627921）僅存在2個堿基的差異，開放閱讀框（ORF）的長度為1560 bp，編碼519個氨基酸，編碼蛋白分子量為57.84 kD，等電點（pI）為6.08，脂肪系數(shù)為80.46%，總平均親水性指數(shù)為-0.195，為親水性蛋白，含有1個信號肽、6個從內部到外部的跨膜螺旋區(qū)和5個從外部到內部的跨膜螺旋區(qū)，定位于細胞核和內質網中，屬于GRAS蛋白家族成員，具有該家族的保守結構域。MeSCL蛋白三級結構模型顯示，該蛋白含有14個典型的α螺旋、10個β-折疊和36個β-轉角。MeSCL蛋白與橡樹HbSCL蛋白的相似性最高，為90.80%，與蓖麻RcSCR、胡楊PeSCL、毛果楊PtSCR、可可樹TcSCR和哥倫比亞錦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右。MeSCL基因受干旱、鹽、氧化和低溫脅迫誘導表達量整體呈升高趨勢，但在不同處理時間的表達量存在明顯差異，其中，干旱和氧化脅迫下，MeSCL基因均在處理24 h時表達量最高，分別是對照的6.05和11.17倍，而鹽和低溫脅迫下，MeSCL基因均在處理6 h時表達量最高，分別是對照的11.76和3.80倍。【結論】MeSCL基因參與木薯植株的非生物脅迫響應，正向調控其抗非生物脅迫能力。

關鍵詞： 木薯;SCARECROW-LIKE（SCL）基因;基因克隆;生物信息學分析;非生物脅迫;表達分析

中圖分類號： S533.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1888-08

Cloning， bioinformatics analysis and expression under abiotic stress of SCARECROW-LIKE（SCL） gene in cassava

FAN Zhu-peng1， LUO Xing-lu1，2*， SHAN Zhong-ying1， HUANG Tang-wei1，

CHENG Long-xiang1， WU Mei-yan1

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】In this study，the SCARECROW-LIKE（MeSCL） gene of cassava was cloned，then its bioinformatics analysis was carried out and? its expression under abiotic stress was detected to provide theoretical reference for further study on the regulatory mechanism of MeSCL gene in response to abiotic stress. 【Method】Taking cassava variety D346 as material，the coding region（CDS） sequence of MeSCL gene was cloned by RT-PCR，and its structural characteristics were analyzed by bioinformatics analysis software，then observed the expression of MeSCL under drought，salt，oxidation and low temperature stresses by real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR）. 【Result】The full-length CDS sequence of MeSCL gene in cassava was 1655 bp. According to alignment with existing target gene sequences on NCBI（GenBank accession No.：LOC110627921），there were two different bases. The length of open reading frame（ORF） was 1560 bp and encoded 519 amino acids，the encoded protein molecular weight was 57.84 kD and the isoelectric point（pI） was 6.08. The fat coefficient of MeSCL protein was 80.46%，total average hydrophilic index was -0.195， which belonged to hydrophilic protein. The MeSCL protein had a signal peptide with six possible internal to external transmembrane helix regions and five possible external to internal transmembrane helix regions. The subcellular localization predicted that the protein was in the nucleus and endoplasmic reticulum and was a member of the GRAS family with the conserved structural domain of the GRAS family. The three-dimensional structure model of MeSCL protein showed that the protein had 14 typical alpha helices，10 beta folds and 36 beta turns. MeSCL amino acid sequence shared the highest similarity of 90.80% with Hevea brasiliensis（HbSCL） protein sequence，about 80.00% similarity with Ricinus communis（RcSCR），Populus euthoides（PeSCL），P. euthoides（PtSCR），Theobroma cacao（TcSCR） and Colombian mallow（HuSCL）. The qPCR data showed that MeSCL gene expression level were increased under drought，salt，oxidation and low temperature stress.However，there were obvious differences in the expression levels at different treatment times. The expression levels of MeSCL genes were the highest at 24 h under drought stress and oxidative stress，which were 6.05 times and 11.17 times as that of the control group. While the expression levels of MeSCL genes were the highest at 6 h under salt stress and cold stress，which were as 11.76 times and 3.80 times as that of the control group respectively. 【Conclusion】The MeSCL gene participates in the abiotic stress response of cassava plants and positively regulates its resistance to abiotic stress.

Key words： cassava; SCARECROW-LIKE（SCL） gene; gene cloning;bioinformatics analysis; abiotic stress; expression analysis

Foundation item： Guangxi Science and Technology Planning Project（Guike AB18221127）; Open Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources（SKLCUSA-b201609，SKLCUSA-b201704）; Independent Research Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources（SKLCUSA-a201802）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculereta Crantz）又稱樹番薯、樹木薯，是大戟科木薯屬植物，在全球熱帶地區(qū)廣泛栽培，我國以廣西、廣東、海南等省（區(qū)）種植較多（楊文鈺和屠乃美，2003）。木薯種植地域廣，其生長發(fā)育面臨多種非生物脅迫。SCARECROW-LIKE（SCL）轉錄因子是GRAS蛋白家族成員之一（Pysh et al.，1999），早期研究發(fā)現(xiàn)其在根和芽的徑向圖案化中發(fā)揮重要作用（Gao et al.，2004），后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其還在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成和抗逆性中發(fā)揮重要作用（郭華軍，2009;Cui et al.，2014;Li et al.，2018）。因此，深入研究SCL基因的逆境脅迫響應機制對木薯品種抗逆性改良具有重要意義。【前人研究進展】GRAS由最初的3個家族成員GIBBERELLIN-INSENSITIVE（GAI）、REPRESSOR of ga1-3（RGA）和SCARECROW（SCR）的特征字母命名。GRAS家族蛋白是植物所特有，廣泛存在于擬南芥、木薯、番茄、矮牽牛、百合、水稻和大麥等高等植物中，含有5個高度保守的結構域，即LRI、VHIID、LRII、PFYRE和SAW（Bolle，2004）。大量研究表明，GRAS家族蛋白是參與細胞過程的重要調節(jié)成分，可調節(jié)植物分生組織生長，影響赤霉素（GA）信號轉導，響應生物和非生物脅迫，促進根瘤和菌根形成（張文霞等，2016）。早期在擬南芥突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，SCR控制著根和芽的放射性圖案，且在調節(jié)胚胎和胚根徑向組織中發(fā)揮重要作用（Di Laurenzio et al.，1996）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，SCL也為GRAS蛋白家族成員，同樣參與植物信息傳遞和信號轉導。如SCL3可能是GA信號傳導中的正調節(jié)因子，在GA途徑中的空間整合縱向根軸上發(fā)揮不同的作用;在延伸組織和分化組織中，SCL3作為GAI和RGA的衰減劑，控制根細胞伸長的協(xié)調，而在分生組織區(qū)中，SCL3-DELLA相互作用維持GA信號傳導，并結合SCR/SHR途徑，調節(jié)成熟基本組織形成分裂的時間和程度（Heo et al.，2011）。研究還發(fā)現(xiàn)SCL3作為擬南芥幼苗中DELLA蛋白的直接靶基因，其表達由DELLA蛋白誘導并被GA所抑制，是GA信號傳導的正調節(jié)因子;且SCL3和DELLA在控制下游GA響應基因和上游GA生物合成基因時相互拮抗，從而實現(xiàn)GA穩(wěn)態(tài)并控制GA介導的植物生長和發(fā)育（Zhang et al.，2011）。從松樹和板栗中克隆出PrSCL1和Cs-SCL1基因，在植株不定根形成早期階段可受外源激素誘導在有生根能力的插條中表達（Sanchez et al.，2007）。此外，SCLs基因在光信號傳導和物資運輸方面也發(fā)揮重要作用，SCL21和PHYTOCHROME A SIGNAL TRANSDUCTION1（PAT1）參與光敏色素A（phyA）信號傳導，并在phyA信號通路中起正向調控作用（Torres-Galea et al.，2013）;SCL23和SCR是控制維管束鞘細胞命運的決定因素，其中，SCR主要參與糖運輸，而SCL23主要參與礦物運輸（Cui et al.，2014）。【本研究切入點】目前有關SCLs基因的研究主要集中于模式植物擬南芥根的生長發(fā)育及GA代謝途徑，但鮮見有關木薯SCLs基因的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以木薯品種D346為材料，采用RT-PCR克隆MeSCL基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用生物信息學分析軟件進行序列特征分析，采用實時熒光定量PCR檢測其在干旱、鹽、氧化和低溫脅迫下木薯葉片中的表達情況，為深入研究木薯MeSCL基因響應非生物脅迫的調控機制提供理論參考，以期發(fā)掘木薯抗非生物脅迫的關鍵基因，為后續(xù)木薯品種抗逆性改良提供基因資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試木薯品種為D346，由廣西大學農學院木薯課題組提供。高保真酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;HiScript Ⅱ qRT SuperMix反轉錄試劑盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自諾維贊生物科技（南京）有限公司;超快新型植物RNA提取試劑盒購自華越洋生物科技（北京）有限公司。主要儀器設備：GXZ型智能光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、NanoDrop ND2000超微量紫外分光光度計（Thermo Scientific，美國）、CFX96 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、JY600C電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、TGL-16M高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1. 2 樣品處理及采集

2018年3月24日將木薯D346種植于廣西大學科研教學基地，于木薯塊根成熟期采集木薯葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于基因克隆。逆境脅迫處理：采用盆栽土培法，正常澆水，3個月后選取長勢一致的木薯苗，分別進行干旱[20%聚乙二醇6000（PEG-6000）]、氧化（10% H2O2）、低溫（4 ℃）和鹽（300 mmol/L NaCl）脅迫處理，前三者分別在處理0（對照）、2、6和24 h取木薯苗正4葉，后者在處理0（對照）、2、6和72 h取木薯苗正4葉，葉片經液氮速凍后采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測不同脅迫處理下MeSCL基因的表達情況。

1. 3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

取少量木薯葉片置于研缽中，加入液氮后迅速研磨成粉末，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，用NanoDrop2000超微量分光光度計測定其濃度。參照Prime ScriptTMⅡFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明反轉錄合成cDNA第一鏈。

1. 4 基因克隆

從本課題組前期試驗獲得的木薯干旱脅迫轉錄組數(shù)據(jù)中篩選出1個差異表達基因，使用Primer Premier 5.0設計其編碼區(qū)（CDS）特異引物（MeSCL-F和MeSCL-R）（表1）。以cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。反應體系50.0 μL：2×PrimerSTAR Max Premix 25.0 μL，10 μmol/L正、反向引物（ORF-F和ORF-R）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用DNA純化回收試劑盒進行回收，連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送至廣州艾基生物技術有限公司測序。

1. 5 生物信息學分析

利用NCBI在線工具ORFfinder查找MeSCL基因的開放閱讀框（ORF），將其翻譯成氨基酸序列，并對氨基酸序列進行BLASTp同源比對。利用ExPASy在線工具ProtParam和ProtScale分析MeSCL蛋白的理化性質;使用TMPRED預測該蛋白的跨膜區(qū);利用PSORT預測該蛋白的亞細胞定位;利用NCBI的CD-search（Conserved domains search database）預測該蛋白的保守結構域。利用SWISS-MODEL和RasMol預測分析MeSCL蛋白的三級結構;用MEGA-X中的鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測

分別提取不同脅迫處理下木薯正4葉的總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈。利用Primer Premier 5.0設計MeSCL基因的定量引物（QMeSCL-F和QMeSCL-R）（表1）。以cDNA為模板、MeActin為內參基因，實時熒光定量PCR檢測MeSCL基因在脅迫處理下的表達情況。反應體系10.0 mL：cDNA模板1.0 mL，10 mmol/L正、反向引物各0.2 mL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5.0 mL，ddH2O 3.6 mL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。

1. 7 統(tǒng)計分析

用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算MeSCL基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結果與分析

2. 1 MeSCL基因克隆

如圖1所示，以木薯葉片cDNA為模板PCR擴增獲得1條長約1600 bp的片段。使用DNAMAN 6.0將該序列與已知參考序列SCARECROW-LIKE（GenBank登錄號LOC110627921）進行比對，結果顯示該片段長度為1655 bp，與參考序列僅有2個堿基的差異（圖2），表明該片段為MeSCL基因的CDS序列。

2. 2 生物信息學分析結果

MeSCL基因ORF的長度為1560 bp，編碼519個氨基酸，編碼蛋白分子量為57.84 kD。MeSCL蛋白質等電點（pI）為6.08，脂肪系數(shù)為80.46%，總平均親水性指數(shù)為-0.195，屬親水性蛋白，含有1個信號肽、6個從內部到外部的跨膜螺旋區(qū)和5個從外部到內部的跨膜螺旋區(qū)，定位于細胞核和內質網中。MeSCL蛋白的保守結構域預測結果表明，該蛋白屬于GRAS家族成員，具有該家族的保守結構域（圖3）。利用SWISS-MODEL對MeSCL蛋白進行同源建模，以獲得其三級結構模型（圖4），利用RasMol對該模型進行分析，結果顯示該蛋白具有14個典型的α螺旋、10個β-折疊和36個β轉角。利用NCBI在線工具BLASTp將MeSCL蛋白的氨基酸序列進行同源比對，結果發(fā)現(xiàn)其與橡樹（Hevea brasiliensis）HbSCL蛋白（XP_021662072.1）的相似性最高，為90.80%，與蓖麻（Ricinus communis）RcSCR（XP_002529844.1）、胡楊（Populus euphratica）PeSCL（XP_011004025.1）、毛果楊（P. trichocarpa）PtSCR（XP_002302035.3）、可可樹（Theobroma cacao）TcSCR（XP_007050241.2）和哥倫比亞錦葵（Herrania umbratica）HuSCL（XP_021281121.1）蛋白的相似性均在80.00%左右（圖5）。可見，SCL基因在物種進化和分化過程中未發(fā)生明顯變異。

2. 3 MeSCL蛋白的系統(tǒng)進化分析結果

從上述BLASTp同源比對結果中，選擇與MeSCL蛋白氨基酸序列同源性高的蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建，結果（圖6）顯示，MeSCL蛋白與橡樹HbSCL（XP_021662072.1）、蓖麻RcSCR（XP_002529 844.1）和麻風樹JcSCR（XP_012085853.1）蛋白同處一個分支，其中，與橡樹HbSCL蛋白親緣關系最近，與可可樹TcSCR（XP_007050241.2）和哥倫比亞錦葵HuSCL（XP_021281121.1）蛋白親緣關系較遠。可見，不同植物SCL蛋白的氨基酸序列具有高度保守性。

2. 4 MeSCL基因的表達分析結果

實時熒光定量PCR檢測結果（圖7）顯示，與對照相比，MeSCL基因受干旱、鹽、氧化和低溫脅迫誘導時表達量整體呈升高趨勢，但在不同處理時間的表達量存在明顯差異，其中，干旱和氧化脅迫下，MeSCL基因均在處理24 h時表達量最高，分別是對照的6.05和11.17倍，而鹽和低溫脅迫下，MeSCL基因均在處理6 h時表達量最高，分別是對照的11.76和3.80倍，處理24和72 h后表達量下調。可見，MeSCL基因能快速響應干旱、鹽、低溫和氧化等逆境脅迫，尤其在鹽和低溫脅迫下最明顯，推測植株受到的損傷也較嚴重，導致后期表達量明顯下降;雖然MeSCL基因在不同脅迫處理下表達模式存在明顯差異，但均表明MeSCL基因參與木薯植株的非生物脅迫響應，正向調控其抗非生物脅迫能力。

3 討論

雖然GRAS蛋白在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但目前對木薯GRAS蛋白缺乏深入研究。通過對植物進行脅迫處理，在不同生長時期進行采樣，克隆抗脅迫相關基因，并進行功能研究，可擴展植物抗逆基因庫，為綜合改良植物抗逆性提供思路和參考（王雪，2017）。本研究從木薯D346中克隆MeSCL基因CDS序列，長度為1655 bp，編碼519個氨基酸，與參考序列（GenBank登錄號LOC110627921）存在2個堿基差異，但編碼的氨基酸序列無差異，推測是由木薯品種間差異所導致。將MeSCL蛋白與其他物種SCL蛋白進行氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)進化分析，結果顯示，MeSCL蛋白與橡樹HbSCL蛋白的相似性最高，為90.80%，說明二者親緣關系較近，且與胡楊PeSCL、蓖麻RcSCR和哥倫比亞錦葵HuSCL蛋白相似性也較高，均在80.00%左右，表明SCL基因在物種進化和分化過程中未發(fā)生明顯變異。經MeSCL蛋白的結構域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有GRAS家族的保守結構域，證明本研究克隆所得到的MeSCL基因屬于GRAS基因家族成員。

植物在生長發(fā)育過程中常受到生物和非生物脅迫的影響，如病原侵染、干旱、高滲透和低溫等均對植物生長發(fā)育帶來極大的負面影響。植物為了適應多變的生長環(huán)境，在長期的進化歷程中，植物形成多種抗脅迫機制，并積累了豐富的抗逆基因，通過抗逆基因的表達調控來響應上述各種逆境脅迫，以提高植株的抗脅迫能力（Seki et al.，2002;周芳，2013）。本研究采用實時熒光定量PCR檢測MeSCL基因在不同脅迫處理下的表達情況，結果顯示，MeSCL基因受干旱、鹽、氧化和低溫脅迫誘導，在木薯葉片中的表達量整體呈升高趨勢，表明MeSCL基因參與木薯的非生物脅迫響應。目前已有許多前人研究證明，GRAS基因家族成員參與植物非生物脅迫響應。如郭華軍（2009）通過擬南芥AtSCL15突變體表型研究證明AtSCL15基因積極響應干旱脅迫;Ma等（2010）研究顯示，將胡楊PeSCL7基因轉入擬南芥中過表達，可增強轉基因植株的抗旱性和耐鹽性;郭鵬等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，轉入玉米ZmSCL基因的煙草在抗鹽試驗中萌發(fā)率在90%以上，而野生型的萌發(fā)率不足50%，表明ZmSCL基因響應鹽脅迫，可提高轉基因植株的抗鹽性;周蓮潔等（2013）研究結果顯示，鹽穗木HcSCL13基因在鹽脅迫下表達量顯著上調;Li等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁BrLAS作為GRAS家族轉錄因子基因，可正向調控植株的干旱耐受性。綜上所述，SCL蛋白在植物響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，能幫助植物提高不良環(huán)境因子抵抗力。在今后研究中，可構建植物過表達載體或iRNA干擾載體使Me-SCL基因在植物中過表達或沉默，從而進一步研究和驗證MeSCL基因在植物生長發(fā)育及抗逆境脅迫過程中的功能。

4 結論

MeSCL基因參與木薯植株的非生物脅迫響應，正向調控其抗非生物脅迫能力。

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（責任編輯 陳 燕）

收稿日期：2019-10-27

基金項目：廣西科技計劃項目（桂科AB18221127）;亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題（SKLCUSA-b201609，SKLCUSA-b201704）;亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室自主研究課題（SKLCuSA-a201802）

作者簡介：*為通訊作者，羅興錄（1957-），博士，教授，主要從事木薯育種與栽培生理研究工作，E-mail：luoxinglu@sina.com。樊鑄硼（1995-），研究方向為作物栽培與理論技術，E-mail：1018775429@qq.com