牛膝促神經干細胞增殖的有效部位篩選

楊芊芊 高歌 王瀚澤

摘要 目的：研究牛膝不同提取分離部位對體外培養的神經干細胞增殖的作用。方法：采用系統溶劑法以及柱色譜法將牛膝分成不同部位，以CCK-8法檢測牛膝各部位對體外培養的神經干細胞增殖的效果，并篩選出較好的作用部位和濃度。結果：牛膝正丁醇部位（25 μg/mL，P<0.01）和其多糖部位（12.5 μg/mL，P<0.01）對神經干細胞增殖活性有明顯促進作用。結論：牛膝正丁醇部位和多糖部位可能是其促神經干細胞增殖的主要活性部位。

關鍵詞 牛膝;神經干細胞;增殖;活性部位篩選

Abstract Objective：To study the effects of different extracted parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells cultured in vitro. Methods：The systemic solvent method and column chromatography were used to separate the twotoothed achyranthes root into different parts. The effects of various parts of twotoothed achyranthes root on the proliferation of neural stem cells were detected by CCK-8 method， and the optimal parts and concentration was screened. Results：The n-butanol part（25 μg/mL，P<0.01）and the polysaccharide part（12.5 μg/mL， P<0.01）significantly promoted the proliferation of neural stem cells. Conclusion：The n-butanol and polysaccharide part of twotoothed achyranthes root may be the main part for promoting the proliferation of neural stem cells.

Keywords Twotoothed achyranthes root; Neural stem cells; Proliferation; Bioactive part screening

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.002

多數神經系統疾病如阿茲海默癥、帕金森氏癥、亨廷頓氏癥均顯示與功能性神經細胞大量丟失相關[1]。神經細胞的恢復高度依賴于神經干細胞，神經干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）作為一類神經前體母細胞，不僅具有高度自我更新能力，而且存在多向分化的潛能[2]。NSCs主要存在于哺乳動物的中樞神經系統，如腦室下區和海馬區齒狀回[3]。在特定的環境中，NSCs的增殖分化過程受到胞內信號分子以及胞外信號分子的調控，隨后增殖分化成包括神經元、少突膠質細胞和星狀膠質細胞等在內的不同類型的神經細胞[4]。而NSCs由于其高度的自我更新能力以及可塑潛能成為目前應用前景廣闊的細胞替代療法[5]。

中醫認為腎和腦關系密切，腎為先天之本，藏精生髓，上通于腦，因此，腎精不足，髓海失充，治療時以補腎填精為主。牛膝為莧科牛膝屬植物Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，牛膝味甘性微溫，入肝腎經，具有補肝腎，強筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝中含有齊墩果酸型三萜皂苷類化合物、甾酮類化合物以及多糖類化合物等多種化學成分[7]，因而具有多種藥理活性，如促進大鼠NSCs的再生作用[8]、調節免疫作用[7]等。在本課題組關于人參皂苷、三七皂苷等中藥活性成分對NSCs存活、增殖和分化的藥理作用機制探討中已成功分離培養了胚鼠NSCs，并通過免疫熒光染色鑒定為NSCs，且純度達到95%[9-11]?；诖?，本實驗旨在研究牛膝的不同提取分離部位對體外培養的胚鼠NSCs的增殖作用，為進一步探索牛膝促NSCs增殖的物質基礎與作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠1只，約450 g，懷孕15～17 d，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0002，飼養于北京中醫藥大學良鄉動物房，于室溫約24 ℃，自然晝夜節律飼養，自由進食飲水。

1.1.2 藥物 牛膝（安國市昌達中藥材飲片有限公司，批號1901001），經北京中醫藥大學中藥學院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM/F12（賽默飛公司，美國，貨號：C11330500BT），B27添加劑（賽默飛公司，美國，貨號：17504-044），胎牛血清（天杭生物科技公司，貨號：70220-8611），bFGF（賽默飛公司，美國，貨號：DXT-13256029），CCK-8（同仁化學研究所，日本，貨號：CK04）;倒置相差顯微鏡（尼康公司，日本，型號：ECLIPSE Ts2），二氧化碳恒溫培養箱（賽默飛公司，美國，型號：3111），酶標儀（Bio Tek公司，美國，型號：Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 牛膝不同分離部位的制備 牛膝經70%乙醇回流提取，濃縮，得牛膝醇提物。醇提水沉后，得牛膝沉淀和牛膝上清;牛膝上清經水飽和正丁醇萃取，濃縮后得到牛膝正丁醇部位和剩余水部位。

1.2.2 牛膝多糖部位的制備 將1.2.1中的牛膝藥渣烘干，加水煎煮，濃縮，濃縮液緩慢加乙醇并攪拌至含醇量為80%，沉淀用80%乙醇洗滌，經脫蛋白后制得牛膝多糖部位。

1.2.3 牛膝正丁醇部位經大孔樹脂洗脫的制備 ? 牛膝正丁醇部位過AB-8型大孔樹脂柱，以水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進行梯度洗脫，經濃縮后得不同洗脫部位，依次編號為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。

1.2.4 完全培養基的配制 DMEM/F12、bFGF、B27和青鏈霉素配制成NSCs無血清的完全培養基。

1.2.5 藥物的配制 牛膝的各部位均用完全培養基配制成1 000 μg/mL的儲備液，過濾膜除菌，保存至4 ℃冰箱。實驗前用完全培養基稀釋成相應濃度的工作液。

1.2.6 NSCs原代培養 將孕鼠麻醉，取出胎鼠，置于75%乙醇中。在超凈臺內解剖胎鼠，取出大腦，分離海馬組織并將其轉移至DMEM/F12培養基中，剪碎，用無菌吸管吹打至無組織團塊，加胰蛋白酶消化，10%胎牛血清終止消化，離心，棄上清，加完全培養基并吹打成細胞懸液，過200目細胞篩后得單細胞懸液，調整細胞密度為1.0×106/mL，接種于細胞培養瓶內，置于培養箱中培養，觀察細胞生長情況，每2～3 d半量換液，每5～7 d傳代。

1.2.7 檢測指標與方法 將第3代狀態良好的NSCs以5.0×105/mL密度接種于96孔板中，每組5個復孔，每孔加入100 μL細胞懸液，然后在各給藥組中分別加入100 μL不同濃度的牛膝提取物的工作液。其中牛膝醇提物、牛膝多糖、牛膝上清、牛膝沉淀、牛膝正丁醇部位和剩余水部位的終濃度依次為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL;而牛膝正丁醇層過大孔樹脂的各洗脫部位Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6的終濃度依次為1.55 μg/mL、3.1 μg/mL、6.2 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL。對照組各孔分別加入100 μL完全培養基。藥物調零組（不含細胞）各孔分別加入100 μL完全培養基和100 μL對應濃度的各藥物的工作液。空白調零組（不含細胞）各孔分別加入200 μL完全培養基。置于培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，于培養箱中培養4 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD）值。實驗平行3次。細胞增殖率的計算公式如下：增殖率（%）=[（OD調整給藥組-OD調整對照組）/OD調整對照組]×100%。其中，OD調整給藥組=給藥組OD值-藥物調零組OD值;OD調整對照組=對照組OD值-空白調零組OD值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCs原代培養與鑒定 剛接種時，在顯微鏡下可見均勻分布且透亮圓球狀的單個細胞懸浮生長;24 h后鏡下觀察可見由數個細胞聚集成不規則透亮的細胞團，周圍懸浮著一些透光性差的細胞碎片;72 h后鏡下可見立體感強且折光率大的類圓形神經球，同時存在少量細胞貼壁生長;5～7 d后，鏡下可見大量神經球且神經球的體積和數量隨著培養時間延長而變大增多。傳代后的NSCs，細胞碎片明顯減少，鏡下視野更純凈。見圖1。上述經原代分離培養得到的NSCs，在本課題組前期實驗工作中已被鑒定為NSCs，且純度達95%[11]。

2.2 牛膝醇提物與牛膝多糖對NSCs增殖能力的影響 本實驗通過CCK-8法檢測各組吸光度值，并采用1.2.7中的公式對其增殖率進行計算，結果見表1、圖2。牛膝多糖（6.25 μg/mL，12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）對NSCs的增殖有顯著的促進作用。

2.3 牛膝上清與牛膝沉淀對NSCs增殖能力的影響 ?牛膝上清（25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，P<0.05）對NSCs的增殖有顯著的促進作用;牛膝沉淀與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2、圖3。

2.4 牛膝正丁醇部位與牛膝剩余水部位對NSCs增殖能力的影響 牛膝正丁醇部位（12.5 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，P<0.05）對NSCs的增殖有顯著的促進作用;剩余水部位與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），結果如表3及圖4所示。

2.5 牛膝正丁醇部位過大孔樹脂柱后，其各洗脫部位對NSCs增殖能力的影響 水和10%、30%、50%、70%、90%的乙醇梯度洗脫，得不同洗脫部位，依次編號為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5和Fr.6。其多個洗脫部位（Fr.2，Fr.3，Fr.4，Fr.5，Fr.6）均顯著地促進NSCs增殖（P<0.05），當藥物濃度為3.1 μg/mL時，Fr.3，Fr.4，Fr.5和Fr.6部位促NSCs增殖能力最佳。見表4、圖5。

3 討論

神經退行性疾病是全球老年人中發病率較高的疾病之一，其缺乏有效的治療手段，嚴重危害其身心健康。該疾病是由于神經元及髓鞘逐漸喪失而導致的神經功能障礙[12]。NSCs是一類具有增殖、遷移和分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的細胞群[2]。其自我更新能力和分化潛能為神經退行性疾病的治療提供了廣闊前景，最大程度地激發內源性NSCs增殖、遷移至病灶（損傷區域），可促使其分化成相應的神經細胞，參與神經修復并恢復大腦受損功能。

中醫的腎-腦相關理論源于《黃帝內經》“人始生，先成精，精成而腦髓生”“腦為髓之?！钡扔涊d。腎精化生為腦髓，髓海得養，腦的生理功能才可以發揮正常[13]。中醫所指的“腦髓”，類似于現代生物學基礎的腦內神經元和神經營養因子，當腦內神經元大量丟失會造成“髓海不足”，故可以通過“補腎填髓”法來治療“髓?？仗摗钡哪X部疾病[14]。中醫理論中的“精”（先天之精和后天之精）與現代醫學中的干細胞有密切的聯系，干細胞的屬性與“精”的繁衍、生長發育、濡養的作用類似，因此可推測干細胞是先天之精在細胞層次的存在形式[15]。吉云鵬[16]通過補腎方藥對腎虛大鼠進行干預，探究腎主藏精和海馬神經干細胞增殖的內在關系，發現補腎方藥可通過激活Wnt信號通路來調控并促進NSCs的增殖和分化。

牛膝味甘性微溫，入肝腎經，具有補肝腎，強筋骨，引血下行等功效[6]。牛膝作為一種使用歷史悠久的常用中藥，其在《本草經集注》中記載：治傷中少氣，補中續絕，益精，填骨髓，除腦中痛;在《本草綱目》中記載：其滋補之功，如牛之多力也?，F代藥理研究表明牛膝可提高海馬神經元的活力，促進海馬神經元突起生長及突觸的形成[17]。

實驗結果表明，牛膝正丁醇部位及其多糖部位對NSCs增殖有明顯的促進作用，為尋找其作用的物質基礎，并進一步探索其作用機制奠定了基礎。

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（2019-10-01收稿 責任編輯：王明）