葛根芩連湯治療糖尿病骨質疏松大鼠的效果及機制

王雅婷 蘭麗珍

摘要 目的：研究葛根芩連湯治療糖尿病性骨質疏松大鼠的效果及機制。方法：雌性SD大鼠60只，隨機均分為3組。對照組20只無處理，余40只腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，建立大鼠糖尿病模型。葛根芩連湯組：按生藥量10 g/kg葛根芩連湯灌胃，模型組同法以0.9% NaCl灌胃，持續灌胃12周。行大鼠空腹胰島素水平（Fins）、空腹血糖（FBG）、胰島素敏感指數（ISI）及素抵抗指數（HOMA-IR）檢測。RT-PCR、Western Blot檢測椎體BMP-2/Smad表達變化，進一步行骨密度、骨鈣含量及生物力學性能測定及HE染色。結果：模型組素HOMA-IR，FBG水平較對照組均升高，Fins及ISI降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，FBG水平與模型組比較降低，Fins及ISI均升高（P<0.05）。模型組大鼠椎體BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的表達較對照組降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白較模型組升高（P<0.05）。模型組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應力和彈性模量較對照組降低（P<0.05）;葛根芩連湯組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應力和彈性模量與模型組比較升高（P<0.05），HE染色示葛根芩連湯治療后大鼠骨質疏松減輕。結論：葛根芩連湯在降低DOP大鼠血糖水平，減輕胰島素抵抗，通過調高BMP-2/Smad通路發揮治療大鼠DOP的作用。

關鍵詞 葛根芩連湯;糖尿病;空腹胰島素水平;空腹血糖;大鼠;骨質疏松;通路;機制

Abstract Objective：To study the efficacy and mechanism of Gegen Qinlian Decoction（GQD）in the treatment of diabetic osteoporosis rats. Methods：A total of 60 female SD rats were randomly divided into 3 groups. The control group did not receive any treatment， and the remaining 40 were intraperitoneally injected with streptozotocin 35 mg/kg once to establish a rat model of diabetes. GQD group：According to the crude drug amount 10 g/kg， GQD was intragastrically administered to the rats. The model group was intragastrically administered with 0.9% NaCl for 12 weeks， and the rats， fasting insulin level（Fins）， fasting blood glucose（FBG），insulin sensitivity index（ISI）and hormone resistance index（HOMA-IR）were detected. RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of BMP-2/Smad pathway in vertebral body， and the bone mineral density， bone calcium content， biomechanical properties and HE staining were further determined. Results：Compared with the control group， the HOMA-IR， the FBG level in rats of model group increased， and the Fins and ISI decreased（P<0.05）.Compared with the model group， the HOMA-IR， the FBG level decreased， and the Fins and ISI were increased in the GQD group（P<0.05）.Compared with the control group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the model group was significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the GQD group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the model group were significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the GQD group were significantly increased（P<0.05），HE staining showed that osteoporosis was alleviated in rats after treatment with Gegen Qinlian decoction. Conclusion：GQD can reduce the blood glucose level of diabetic osteoporosis rats and alleviate insulin resistance， and may play a role in the treatment of diabetic osteoporosis by increasing the BMP-2/Smad pathway.

Keywords Gegen Qilian decoction; Diabetes; Fins; FBG; Rat; Osteoporosis; Pathway; Mechanism

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.010

2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）約占糖尿病總病例的90%，它引起多種并發癥，目前對于心血管和神經、腎臟及外周血管的相關研究最多，但是其對機體的影響和破壞性不止如此，臨床和基礎研究表明2型糖尿病的內分泌和代謝紊亂影響骨骼形成和代謝[1-2]，臨床表現為2型糖尿病患者常同時伴有骨質疏松癥，如何對糖尿病骨質疏松癥（Diabetic Osteoporosis，DOP）進行有效的干預和治療為目前破待解決的問題，最好是對2型糖尿病及骨質疏松具有治療效果且不良反應小的藥物或方案[3-4]。傳統中藥方劑葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）對2型糖尿病有顯著的治療效果[5]，同時有研究顯示葛根對治療骨質疏松亦有治療效果[6]，故本研究以糖尿病骨質疏松癥（DOP）大鼠模型為研究對象，探討葛根芩連湯對DOP大鼠的療效和可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠60只（康寶生物，山西），雌性，SPF級，8周齡，體質量體質量210～240 g，大鼠生產許可證號碼：SCXK（晉）2015-0003，飼養于山西醫科大學實驗動物中心，使用許可證號碼：SYXK（晉）2015-0004。濕度50～60%，溫度22～25 ℃，自然晝夜交替，自由飲水飲食。實驗過程符合國家及本地相關實驗動物的法規。

1.1.2 藥物 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，貨號：S0130），葛根、炙甘草、黃連、黃芩（由北京同仁堂太原分店提供）。

1.1.3 試劑與儀器 雙能X線骨密度儀（法國GK公司，型號：CHAILENGE），體質量計（美國GE公司：型號：ZH6632）、BMP-2（批號：ab14933）、β-actin（批號：ab8245）、Smad1、Smad4（批號：ab202445）兔抗大鼠多克隆抗體、HRP山羊抗兔IgG（批號：ab6721）購于英國Abcam公司，由上海生工合成相關引物，Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號P0006）、RT-PCR試劑盒（碧云天公司，批號：D7153），Trizol（北京嘉美紐諾生物科技公司，批號：tr118），Western blot電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號：1645050-OG）。

1.2 方法

1.2.1 建立DOP大鼠模型及分組 經1周適應性飼養后，對照組不做任何處理，余40只，腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg 1次，建立大鼠糖尿病模型，監測血糖2周，檢測血糖值和血清胰島素值，隨機血糖值≥16.7 mmol/L同時表現為對胰島素抵抗，符合2型糖尿病大鼠模型[7]。建模成功后分為模型組及葛根芩連湯組，20只/組。

1.2.2 給藥方法 按生藥量10 g/kg葛根芩連湯灌胃，模型組同法以0.9% NaCl灌胃，持續灌胃12周。葛根芩連湯按《傷寒論》步驟制備：取葛根250 g、黃芩150 g、黃連150 g、炙甘草100 g，用10倍質量的水分別對各中藥20 min浸泡，先煎葛根，水沸后煎煮20 min，加入其余已侵泡的藥湯繼續煎至40 min，濾過后，殘渣中加8倍量的水，煎煮30 min，把2次濾過的湯劑混合，調整全方生藥量2 g/mL，濃縮水煎液后備用。

1.2.3 檢測指標與方法 1）空腹血糖、血清胰島素和HOMA-IR及ISI檢測：治療12周后，每組大鼠眼眶取血，電子血糖儀測量FBG，取大鼠主動脈血，采用ELISA法，行各組大鼠血漿胰島素水平測定。按公式：FBG×Fins/22.5計算HOMA-IR。按公式：1/（FBG×Fins）計算ISI。2）測定骨密度及骨鈣含量：于治療后的12周，每組隨機選大鼠5只，以頸脫臼法處死，在無菌條件下將大鼠的左側股骨取出后，于股骨中點進行標記后，分別進行右側股骨中點、近端及遠端骨密度檢測。CHAILENGE骨密度儀測定并記錄結果。取右側股骨在支架上固定，手術刀將股骨上附著的組織剔除干凈后，通過原子吸收法對其骨鈣含量進行測定。3）股骨生物力學檢測及HE染色：于治療后的12周，每組隨機選大鼠5只，以頸脫臼法處死，大鼠固定于支架上，取出大鼠股骨，將股骨上上附著的組織剔除干凈后，通過三點彎曲實驗對股骨進行生物力學測試，將股骨置于試驗機上測試，跨距設置17 mm，加載速度2.0 mm/min，按結果描繪應力-應變曲線。10%的甲醛對股骨固定后，行組織切片;經梯度酒精脫水，行石蠟包埋，行4～5 μm連續切片，脫蠟后，經HE染色，行光學顯微鏡觀察。4）BMP-2、Smad1、Smad4基因表達檢測：將每組剩余大鼠予以頸脫臼處死，取椎體組織100 mg，液氮冷凍后研磨，Trizol法提取大鼠椎體組織總RNA，測定總RNA含量后，RT-PCR兩步法將mRNA逆轉錄為cDNA，BMP-2上游引物：5′-GGAC TGCGG TCTCCTAAA-3′，下游引物：5′-CA GCCTC AA CTCAAACTCG-3′，產物長度為191 bp;Smad1上游引物：5′-GCAGCACCTACCC TCAC-3′，下游引物：5′-AACCATCCACCAACACG-3′，產物長度為306 bp;Smad4上游引物：5′-CACT ATGAGCGGGTTGT-3′，下游引物：5′-TGTCCTTCCGTGGGTAA-3′，產物長度為137 bp;內參β-actin上游引物：5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，下游引物：5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，產物長度為253 bp。PCR反應條件如下：于94 ℃條件下變性，1 min，于60 ℃溫度下退火，退火時長30 s，72 ℃延伸延伸1 min，共45個循環。5）BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達檢測：將提取后的剩余物按1 500 r/min，離心半徑8 cm，離心30 min后，取上清為粗體蛋白，BCA法行蛋白濃度測定。每組取樣品蛋白40 μg，10%的ADS-PAGE凝膠電泳（70 V，30 min;95 V，90 min），蛋白電泳分離，通過半干法將蛋白電轉于硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;然后加入相應一抗BMP-2、Smad1、Smad4鼠單抗（1∶500）、β-actin鼠單抗（1∶800）4 ℃孵育過夜。PBS將未結合的抗體洗去，加入二抗羊抗兔IgG（1∶800）孵育1 h，洗去未結合蛋白，經ECL發光顯色后，照相后，Quantityone軟件行灰度值分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析（One-way ANOVA）及q檢測，2組比較通過LSD-t法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組FBG、Fins、HOMA-IR及ISI水平 模型組素HOMA-IR，FBG水平較對照組均升高，Fins及ISI較對照組均降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，FBG水平與模型組比較均降低，Fins及ISI與模型組比較均升高（P<0.05）。見表1。

2.2 骨密度及骨鈣含量測定 12周后，模型組股骨BMD及骨鈣含量較對照組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）;葛根芩連湯組股骨的BMD和骨鈣含量較模型組顯著升高（P<0.05）。見表2。表明葛根芩連治療能夠有效地提高糖尿病骨質疏松癥大鼠BMD和骨鈣含量，發揮治療作用。

2.3 生物力學性能的變化 12周后，三點彎曲實驗檢測生物力學性能檢測模型組極限載荷、極限應力和彈性模量明顯低于對照組（P<0.05），葛根芩連湯組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高（P<0.05）。見表3。

2.4 HE染色結果 在治療后的第12周后，模型組可見骨小梁出現斷裂，變稀疏，小梁排列紊亂，間隙擴大。葛根芩連湯組骨小梁窄較之減輕，部分骨小梁較粗，骨小梁排列較之規則、間隙增小于模型組，對照組骨可見組織結構完整，未見骨小梁斷裂，稀疏和排列紊亂。見圖1。

2.5 各組BMP-2/Smad基因表達影響 模型組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因表達較對照組顯著降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因表達較模型組顯著升高（P<0.05）。見圖2、圖3。

2.6 各組BMP-2/Smad蛋白表達影響 模型組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達較對照組顯著降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達較模型組顯著升高（P<0.05）。見圖4、圖5。

3 討論

骨質疏松癥是糖尿病的一種常見并發癥，但在發生骨折前并沒有其他癥狀，DOP主要的發病機制是機體的骨重建失衡，包括破骨細胞數量增多導致的骨吸收加速和成骨細胞檢索導致的骨形成減少[8-9]。流行病學研究中，糖尿病患者表明骨質疏松性骨折的風險與一般人群比較升高，與非糖尿病患者和血糖控制良好的糖尿病患者比較，血糖控制欠佳的糖尿病患者骨折風險增加了47%～62%[10]。然而，導致糖尿病骨質疏松的潛在分子機制仍不清楚，如何有效的對DOP進行治療是目前研究的熱點，目前多數研究關注點在中藥配方及其成分對骨質疏松癥的影響[11]。

本研究我們探討葛根芩連湯對DOP大鼠的影響。古人多用葛根芩連湯治療濕熱所致的痢疾、腹瀉等。現代基礎及臨床研究證實其對于各科疾病均有治療作用[12-13]。葛根芩連湯具有消渴作用，臨床研究證實其能降低糖尿病患者的血糖及血脂，對2型糖尿病有一定療效，基礎研究表明其哪個降低多種動物模型的血糖[14]，同時大量研究顯示葛根及其提取物能夠對骨質疏松發揮治療作用，葛根的功能成份主要以葛根甙類化合物、異黃酮類化合物及三萜皂苷為主，異黃酮類化合物為天然性植物性雌激素，對骨質疏松有治療作用，且具有著不良反應低的特點。鐘偉權等研究表明葛根提取物能夠有效的提高骨密度，升高血清骨轉化指標，能夠促進老年骨質疏松患者骨折愈合，具有較高的應用價值[15-16]。

本研究將葛根芩連湯用于DOP大鼠治療，結果顯示，模型組素HOMA-IR，FBG水平較對照組均升高，Fins及ISI均降低。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，FBG水平與模型組比較均降低，Fins及ISI均升高。這些結果均證明葛根芩連湯可對糖尿病骨質疏松大鼠具有降低血糖，減輕胰島素抵抗的治療作用，從根本上改善了大鼠機體內環境，為緩解糖尿病骨質疏松癥狀提供條件，進一步研究表明在改善大鼠血糖及胰島素水平后，與模型組比較，葛根芩連湯組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應力和彈性模量明顯升高。研究結果表明了大鼠骨質疏松得以改善，骨密度及鈣含量升高，生物力學性能得以提高，分子生物學進一步研究表明與模型組比較，葛根芩連湯組大鼠大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的升高，HE染色示葛根芩連湯治療后大鼠骨質疏松減輕。從此結果可以推斷，葛根芩連湯可能通過調控調高BMP-2/Smad通路，發揮對骨質疏松的治療作用，為DOP治療提供新的思路。

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（2019-10-22收稿 責任編輯：王明）