黑曲霉固態發酵生產柚苷酶的工藝研究

張 楠， 孫西同， 李 僉*， 田 晶， 費 旭， 詹宏磊， 鄭欣雨

1.大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034； 2.大連工業大學 輕工與化學工程學院，遼寧 大連 116034； 3.大連工業大學 分析測試中心，遼寧 大連 116034

柚苷酶(Naringinase)是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)組成的復合酶，柚皮苷是一種類二氫黃酮類化合物，是果汁中重要的苦味物質，還是枳實、化橘紅等幾味中藥的主要有效成分[1]。柚苷酶是一種專一水解柚皮苷的食品工業酶制劑，柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的作用下被水解成普魯寧和鼠李糖，普魯寧在β-D-葡萄糖苷酶的作用下被水解成柚皮素和葡萄糖[2]。因此柚苷酶在果汁脫苦[3]、葡萄酒增香[4]、普魯寧制備[5]、黃酮類轉化[6]、鼠李糖制備[7]以及糖蛋白去硝基化[8]等方面具有很大的應用價值。柚苷酶純品價格昂貴，不適用于大規模使用，所以工業化制備柚苷酶擁有廣闊的研究前景。

工業上生產柚苷酶主要有兩種途徑：包括固態發酵和液態發酵。固態發酵是指發酵培養基中沒有或基本沒有游離水的存在的發酵方式，其原料大多為天然基質或果渣。和液態發酵相比柚苷酶的固態發酵的研究較少，但由于其原料廣泛易得、發酵過程產生的能耗少、且產物污染小、不易污染環境的特點[9]，固態發酵仍具有很大的研究價值。胡奎等[10]采用曲霉SN90進行固態發酵生產柚苷酶，得到最高產酶量1 282 U/mL；張怡等[11]采用A-13-62固態發酵柚苷酶在培養基初始pH為5.0、溫度30 ℃的條件下最高產酶量為1 017 U/mL。我國是柑橘類水果的生產和消費大國，隨之也會產生大量的果皮、果渣。本文章以柑橘類果皮為發酵原料進行黑曲霉固態發酵產柚苷酶的研究，進行固態發酵培養基等參數優化，本實驗為固態發酵產柚苷酶提供了數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

菌株：黑曲霉FFCC uv-11由本實驗室自主保藏

材料：柚皮苷(≥98%)，寶雞市方晟生物開發有限公司；氯化鉀(KCl)、硝酸鈉(NaNO3)、蔗糖、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、一縮二乙二醇(DEG)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、硝酸銨(NH4NO3)、氯化銨(NH4Cl)，均為AR，天津市東麗區天大化學試劑廠；檸檬酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、七水合硫酸亞鐵(Fe2SO4·7H2O)、蛋白胨，AR國藥集團化學試劑有限公司；橙皮、麩皮，實驗室自主保存。

儀器：DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SpectraMaxRPlus384型酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司；iCEN-24R高速冷凍離心機，杭州奧盛儀器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-25ODE數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

斜面培養基(g/L)[12]：3.0 g NaNO3、0.5 g KCl、30 g蔗糖、2.0 g柚皮苷、0.11 g FeSO4·7H2O、1.0 g K2HPO4、1.0 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O、6 g瓊脂粉，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1菌種活化

取出4 ℃下的黑曲霉菌種，在無菌環境下在斜面培養基上劃線，然后培養箱30 ℃恒溫培養4 d，得到成熟的孢子，用無菌0.9%生理鹽水洗孢子并用無菌生理鹽水將OD600值調節至2.0 (1×108個孢子/mL)，即得到孢子懸液[12]。

1.2.2發酵液的獲得

首先制備固態培養基，在250 mL錐形瓶中加入一定量的麩皮、橙皮粉、氮源等，密封瓶口，121 ℃滅菌20 min。然后在無菌環境下接入一定量孢子懸液，在30 ℃恒溫條件下培養8 d。在每個發酵瓶中加入100 mL的檸檬酸緩沖液(pH 5.0，0.01 mol/L檸檬酸-0.02 mol/L磷酸氫二鈉)，30 ℃、140 r/min條件下搖床內振蕩90 min，過濾，在4 ℃冷凍離心機里離心20 min，得到柚苷酶發酵液[13]。

1.2.3接種量對固態發酵產柚苷酶酶活力的影響

在250 mL錐形瓶中添加3.0 g橙皮粉，2.5 g麩皮粉，0.5 g (NH4)2SO4，15 mL去離子水制成固態培養基，將固態培養基滅菌，冷卻到室溫，然后按固態培養基中水分含量的4%、6%、8%、10%(v/v)添加孢子懸液，在30 ℃恒溫培養箱中發酵培養8 d測柚苷酶酶活力。

1.2.4固液比對固態發酵產柚苷酶酶活力的影響

在250 mL錐形瓶中加入3.0 g橙皮粉，2.5 g麩皮粉，0.5 g (NH4)2SO4，再按照固液比為1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3和1∶3.5的比例加入去離子水。然后滅菌冷卻到室溫，加入等量的孢子懸液，30 ℃恒溫培養8 d測柚苷酶酶活力。

1.2.5誘導劑與疏松劑的比例對固態發酵產柚苷酶酶活力的影響

采用橙皮粉為誘導劑，麩皮粉為疏松劑，保持橙皮粉和麩皮粉的總質量為5.5 g，改變橙皮粉和麩皮粉的比例為2∶3.5、2.5∶3、3∶2.5、3.5∶2和4∶1.5，然后向250 mL三角瓶中加入0.5 g (NH4)2SO4和15 mL去離子水，在121 ℃滅菌20 min，冷卻，再加入等量的孢子懸液，30 ℃恒溫培養8 d測柚苷酶酶活力。

1.2.6氮源種類對固態發酵產柚苷酶酶活力的影響

選取NaNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、 NH4NO3和蛋白胨這五種氮源分別添加在固態培養基中，然后加入3.0 g橙皮粉、2.5 g麩皮粉、15 mL去離子水滅菌,冷卻，加入等量的孢子懸液，恒溫培養8 d，測柚苷酶酶活力。

1.2.7正交實驗設計

根據影響黑曲霉發酵產柚苷酶的單因素實驗結果，從每個因素中選取了3個具有代表性的條件，設計了L9(34)的正交實驗因素表，探究最佳的柚苷酶發酵產柚苷酶條件。

1.2.8柚苷酶酶活力的測定

采用改進的Davis[14-17]法：稱取30 mg固定化柚苷酶或0.2 mL游離柚苷酶與0.8 mL的柚皮苷溶液(0.8 mg/mL)混合均勻，將其放入50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，在試管中加入5 mL一縮二乙二醇(體積分數為90%)和0.1 mL NaOH溶液(4mol/L)，取0.1 mL反應酶解液，加入上述試管中，將三者混合均勻，室溫下靜置10 min，于420 nm處測定混合溶液的吸光值。

柚苷酶酶活力(U)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，在1 min里柚苷酶降解1 μg柚皮苷所需要的酶量為一個酶活力單位。酶比活力(U/g或U/mL)的定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 g固定化柚苷酶(或1 mL游離柚苷酶)所表現出的酶活力。

2 結果與討論

2.1 接種量對固態發酵黑曲霉產柚苷酶的影響

在發酵生產中通常采用增加一定程度的接種量來縮短微生物的發酵周期，所以選擇一個適合的接種量對黑曲霉發酵產柚苷酶是很有必要的。如圖1所示，接種量從4%增大到10%時，由于接種量增大，導致生物量增大[18]，因此柚苷酶酶活力增加；當接種量增加到10%時，柚苷酶酶活力達到最大，最高酶活力為15 526.75 U/g。說明接種量為10%(v/v)是黑曲霉發酵產柚苷酶最佳條件，接種量再增加時，發酵所需的營養過快的被消耗[19]，從而導致柚苷酶酶活力有所下降。此結論與RAMACHANDRAN等[20]報道的結論相一致。

圖1 接種量對柚苷酶酶活力的影響

2.2 固液比對固態發酵黑曲霉產柚苷酶的影響

固態發酵的培養基為沒有或基本沒有游離水的固態基質，但是此種固態基質需要足夠的濕度[21]。實驗結果表明(圖2)固液比在1∶1.5時柚苷酶酶活力最低，為4 915.64 U/g。這是由于較低的固液比會降低培養基的多孔性，從而使底物內氣體體積和氣體交換減少，還會很大程度的發生雜菌污染的情況。隨著固液比的增加，柚苷酶酶活力也隨著增加[22]，固液比達到1∶2.5時柚苷酶酶活力最高，最高酶活力為15 526.75 U/g，因為固液比增大，培養基內水分降低，會使發酵中所需的水分不足，底物膨脹度低，減緩菌株的生長速度[23]。

圖2 固液比對柚苷酶酶活力的影響

2.3 誘導劑與疏松劑的比例對固態發酵黑曲霉產柚苷酶的影響

誘導劑是指在發酵過程中起誘導作用的結構類似物，它不能被酶所利用。因為橙皮粉作為誘導劑會誘導黑曲霉的發酵，同時橙皮粉中還含有大量的柚皮苷，柚皮苷在黑曲霉發酵中作為碳源會給黑曲霉的發酵提供營養物質，從而促進黑曲霉的生長提高柚苷酶酶活力。而疏松劑起到疏松底物培養基、給黑曲霉的發酵提供氣體體積的作用[24]。實驗結果如圖3所示，誘導劑與疏松劑比例為3∶2.5時柚苷酶酶活力最好，當疏松劑過多、誘導劑過低時，會減緩黑曲霉的發酵同時提供不了柚苷酶發酵的營養物質，從而導致柚苷酶酶活降低。當誘導劑過多、疏松劑過少時，底物的多孔性降低，瓶內的氣體交換減少，導致柚苷酶酶活力降低[22]。因此選擇誘導劑與疏松劑比例3∶2.5為較適宜的條件。

圖3 誘導劑與疏松劑的比例對柚苷酶 酶活力的影響

2.4 氮源種類對固態發酵黑曲霉產柚苷酶的影響

在發酵工業中，氮源是一些產物代謝過程必不可少的營養元素，氮源還是一些構成菌體的物質，所以在培養基中添加氮源是必要的。實驗結果如圖4所示，氮源為NH4Cl 時柚苷酶酶活力最低，而(NH4)2SO4時柚苷酶酶活力最高，且幾乎為最低值的兩倍。微生物發酵中一般采用蛋白質類的氮源如蛋白胨等為主，但是在固態發酵中由于培養基中加水量少，所以蛋白胨極易和黑曲霉發生粘黏，從而導致黑曲霉與蛋白胨的接觸面減少，而導致黑曲霉發酵緩慢，柚苷酶酶活力降低。所以本實驗條件中采用(NH4)2SO4這類無機氮源柚苷酶酶活力最佳。

圖4 不同氮源對柚苷酶酶活力的影響

2.5 正交實驗

正交實驗設計(Orthogonal experimental design)是一種研究多因素多水平的設計方法，它是一種分式析因的設計方法。它是根據正交性從所有實驗中挑選出“均勻分散，齊整可比”的具有代表性的點進行實驗的，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法[25]。

單個的因素能夠確定每個因素對黑曲霉產柚苷酶的影響，但是不能確定各因素之間的交互作用對柚苷酶酶活力的影響，所以根據上述的四個影響黑曲霉發酵產柚苷酶的單因素實驗結果，從每個因素中選取了3個具有代表性的條件，設計了L9(34)的正交實驗因素表(表1)，探究最佳的柚苷酶發酵產柚苷酶條件。

正交實驗的綜合評分分析是根據各指標的重要性不同, 按照得出的試驗結果綜合分析。而極差是實驗結果綜合分析的重要指標。根據試驗可知結果如表2所示，RA>RB>RD>RC也就是黑曲霉發酵產柚苷酶的因素大小順序為接種量>固液比>氮源加入量>誘導劑與疏松劑的比例，所以，培養基的最優組合為A2B2C3D2。及黑曲霉發酵產柚苷酶最佳條件組合為接種量為10%(v/v)，固液比為1∶2.5，橙皮粉加入量為3.0 g，麩皮加入量為2.5 g，(NH4)2SO4的加入量為0.5 g。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗結果

為了驗證正交實驗得到的最佳固態發酵參數A2B2C3D2，即接種量為10%(v/v)，固液比為1∶2.5，橙皮粉加入量為3.0 g，麩皮加入量為2.5 g，(NH4)2SO4的加入量為0.5 g/瓶。采用以上參數進行黑曲霉固態發酵產柚苷酶的實驗，得到的柚苷酶酶活力高達18 697.49 U/g，高于正交實驗表中實驗結果，因此證明該條件是最優培養條件。

國內外也有一些對于產柚苷酶的研究。吳升山等[26]優化了發酵溫度、菌絲形態、培養基初始pH、接種量和裝液量等發酵條件提高柚苷酶酶活，最大酶活力為420.68 U/mL；錢偉等[13]采用固態發酵產柚苷酶，對其固態培養基條件進行優化，得到最大柚苷酶酶活力為1 248.0 U/g；王聳等[18]采用固態發酵棘孢曲霉產柚苷酶得到最大柚苷酶酶活力8.19 IU/g干物質；NI等[27]進行液態發酵黑曲霉產柚苷酶的研究得到柚苷酶，其酶活力最大為2.58IU/mL；KUMAR等[28]以橙皮和葡萄柚皮為碳源對十二種絲狀真菌進行固態發酵產柚苷酶，得到結論為以柚子皮為底物產柚苷酶酶活力更高，最大酶活力為7.48 IU/mL。與上述研究相比，本實驗研究具有更高的柚苷酶酶活力，因此本實驗研究為固態發酵產柚苷酶提供了更好的實驗依據。

3 結論

以橙皮為碳源，采用固態發酵黑曲霉生產柚苷酶，優化了固態基質中接種量、固液比、誘導劑與疏松劑比例、氮源種類等因素，進一步通過正交實驗得到了較優的實驗條件，結果表明不同實驗因素對柚苷酶發酵酶活的影響程度為接菌量>固液比>氮源濃度>誘導劑與疏松劑比例，在250 mL三角瓶中，當接種量為10%(v/v)，培養基的固液比為1∶2.5，(NH4)2SO4的量為0.5 g，誘導劑與疏松劑比例為3∶2.5時，柚苷酶酶活力最大，最大柚苷酶酶活力為18 697.49 U/g。此條件制備的柚苷酶酶活力相對較高，本研究為工業上固態發酵產柚苷酶提供了實驗依據。