鈴鐺刺花提取物增強機體免疫力及運動抗疲勞作用研究

（寧波職業技術學院 浙江 寧波 315800）

鈴鐺刺花是一種學名為“鹽豆木”的花，主要分布在我國西北及新疆地區鹽堿荒漠地的一種灌木，該植物喜光、耐鹽堿、耐干旱，是良好的固沙、改良鹽堿地的樹種。在中國西北部長期用作高產牧草，其花和嫩葉可供食用，味道鮮美，是當地人喜愛的春季食材，具有極高的營養價值。研究鈴鐺刺花提取物對增強機體免疫力及運動抗疲勞作用，可增強人體對疾病的抵抗力。從天然產物中篩選抗疲勞和增強機體免疫作用的有效成分、研究其作用機制具有重要現實意義。

1、實驗材料

1.1、實驗動物

昆明種小鼠SPF級，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(新)2011-0004。

1.2、實驗試劑

鈴鐺刺花提取物(浸膏)，由昌吉職業技術學院藥學院提供。小鼠血清尿素氮檢測試劑盒，小鼠全血乳酸檢測試劑盒，小鼠肝糖原含量檢測試劑盒，均為南京建成生物工程研究所提供。

1.3、實驗器材

多級閃蒸鍋JMF-320-A；中藥多功能提取罐。

DC-TQ-30；旋轉蒸發器RE-52；循環水式多用真空泵SHB-Ⅲ；Sartorius CP225D型電子天平；小鼠灌胃器；爬桿器具：自制，直徑1cm，長25cm的玻璃棒，砂紙打磨后上端固定在木板上制成爬桿架，下端懸空，玻璃棒下端距離地面30cm，地面鋪上2cm左右的海綿以防止小鼠落下摔傷。游泳箱：根據《保健食品檢驗與評價技術規范》要求自制。紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司。全自動生化分析儀，日本 Beckman Coul-ter K·K。

2、實驗方法

2.1、實驗條件

實驗條件設施齊全，將邀請運動醫學及化學實驗方面的老師進行技術指導，利用學員化工學院基礎實驗室平臺進行實驗，為確保本次課題能順利的完成作出基本保障。

2.2、鈴鐺刺花提取液的制備

鈴鐺刺花提取物(浸膏)，氣味清香，粘稠的棕褐色流浸膏，由昌吉職業技術學院藥學院提供。樣品用蒸餾水稀釋成最大濃度2g·mL-1(以不堵塞灌胃針為標準)，置4℃冰箱備用。

2.3、鈴鐺刺花提取液抗疲勞作用

（1）爬桿實驗。

取小鼠40只，雌雄各半，適應性喂養3天，隨機分為4組，空白組，鈴鐺刺花高、中、低劑量組(4、2和1)g·kg-1，每組 10只。鈴鐺刺花各劑量組分別灌胃鈴鐺刺花提取液，1日1次，1次0.2ml/10g小鼠，空白組同樣每日灌胃0.2ml/10g小鼠的生理鹽水，連續10天。試驗前訓練小鼠兩天，使其學會爬桿。末次給予受試物30min后，將小鼠放在長25cm、直徑1cm、光滑的有機玻璃竿上，使肌肉處于靜力緊張狀態，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時間，第3次跌落時終止實驗，累計3次的時間作為爬桿時間。延長率=(給藥組跌落時間-空白對照組跌落時間/空白對照組跌落時間)×100%。

（2）游泳實驗。

小鼠于末次灌胃后30min，將尾根部負荷5%體質量鉛塊的小鼠投入自制水槽中游泳，水深30cm，水溫30℃，尾部負重沙袋，同時開始計時，記錄小鼠游泳開始至頭部沒入水面以下8s不再上浮的時間，作為小鼠負重游泳時間。

2.4、小鼠游泳后血清尿素氮、血乳酸含量測定

連續灌胃鈴鐺刺花提取液10天，于末次給藥30min后(禁食不禁水)，將小鼠放入水深30cm，水溫30℃水槽中，不負重游泳90min，休息60min后撥眼球取血0.5mL，加肝素抗凝后，以3000r·min－1離心15min，取血清，按照試劑盒的方法測定血清中的乳酸和尿素氮含量。

2.5、小鼠游泳后肝糖原含量測定

連續灌胃鈴鐺刺花提取液10天，于末次給藥30min后(禁食不禁水)，置小鼠放入水深30cm，水溫30℃水槽中，不負重游泳90min，游泳后立即處死，小鼠肝臟用生理鹽水漂洗，再用濾紙吸干，稱重，然后加入堿液破壞組織保留糖原，按樣本重量(9mg)∶堿液體積(μL)=1:3，一起加入試管中，用冰箱保鮮膜將管口扎起，以防水分蒸發，在膜上用針頭扎一小孔，以便氣體熱脹冷縮，沸水浴煮20min，流水冷卻。按試劑盒要求將糖原水解液進一步制備成糖原檢測液，測定肝糖原含量。

2.6、統計分析方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計分析，計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnett比較。兩組比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Sample T Test)。

3、實驗結果

3.1、鈴鐺刺花提取液最大耐受量計算

鈴鐺刺花提取液每人每日推薦量為12g，相當于0.2g.kg-1（成人體重以60kg計），鈴鐺刺花流浸膏濃度為2g·ml-1生藥，灌胃體積為0.02mL.g-1BW，每天灌胃3次，則計算出小鼠的最大耐受劑量MTD為：120g生藥/kg小鼠，根據計算公式得出小鼠MTD相當于人用量的倍數為(小鼠體重以20g計)：

鈴鐺刺花急性毒性在測不出LD 50的情況下，進行了最大耐受量研究，每天給藥3次的最大給藥劑量，體重均有不同程度的增長，實驗結束后對小鼠進行大體病理學觀察，未發現有明顯病理改變，全程實驗動物無死亡，鈴鐺刺花提取液對小鼠的MTD為120g生藥/kg小鼠，相當于成人臨床日用量的300倍，結果證明動物完全能耐受，未出現任何毒性反應，表明鈴鐺刺花食用是安全的。

3.2、鈴鐺刺花提取液對耐力時間的影響

在爬桿試驗當中鈴鐺刺花高和中劑量組小鼠的爬桿時間與空白對照組相比較，具有統計學差異(P＜0.01)，分別使小鼠跌落的時間延長了46.70%和47.53%，低劑量組雖無統計學意義，但也使小鼠的跌落時間延長了13.26%；在抗疲勞游泳實驗中：鈴鐺刺花高和中劑量組小鼠的游泳時間與空白對照組相比較，具有統計學差異(P＜0.01)，但無劑量依賴性趨勢，但此實驗結果充分說明該藥能提高抗疲勞的能力(見表1)。

表1 鈴鐺刺花提取液對小鼠負重游泳時間的影響(x±s)

3.3、鈴鐺刺花提取液疲勞代謝物指標的影響

與正常對照組比較，各給藥組運動后小鼠的血乳酸含量均有降低，其中中劑量組和高劑量組與對照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；與正常對照組比較，各給藥組運動后小鼠的血清尿素氮有降低趨勢，但無統計學意義(P＞0.05)。各給藥組運動后小鼠的肝糖原含量均高于正常對照組，其中中劑量組和高劑量組與對照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；表明鈴鐺刺提取物可以降低實驗小鼠運動后的乳酸和尿素氮的含量，提高實驗小鼠運動后肝糖原的含量(見表2)。

表2 鈴鐺刺花提取液對運動后小鼠疲勞代謝物指標的影響(x±s)

4、討論

本試驗設定的鈴鐺刺花提取物每人每日推薦量為12g，相當于0.2g·kg-1(成人體重以60kg計)；最大給藥量試驗中鈴鐺刺提取物，濃度為 2g·m-1，灌胃體積為 0.02ml·g-1，每天灌胃 3 次，則計算出小鼠的藥物用量為：120g@kg-1，MTD相當于成人臨床日用量的300倍，按體重計算，小鼠1天最大給藥量相當于成人臨床日用劑量的100倍以上則較為安全，表明鈴鐺刺提取物毒性低，動物完全能耐受，未出現任何毒性反應。《保健食品檢驗與評價技術規范》中對緩解體力疲勞功能的判定，認為負重游泳實驗結果陽性，血清乳酸、尿素、肝糖元/肌糖元三項生化指標中任二項指標陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞的作用。本實驗通過小鼠給藥10天后，與空白組比較，鈴鐺刺花提取液中、高劑量均能明顯延長小鼠的游泳和爬竿時間，3個劑量組均能降低運動后小鼠血乳酸含量，其中中劑量組(2g·kg-1)和高劑量組(4g·kg-1)與對照組的差異顯著；同時3個劑量組均能提高運動后小鼠肝糖原的含量，其中中劑量組(2g·kg-1)和高劑量組(4g·kg-1)與對照組的差異顯著；與正常對照組比較，各給藥組運動后小鼠的血清尿素氮有降低趨勢，但無統計學意義。表明鈴鐺刺花提取液可以顯著緩解運動后小鼠的疲勞。

綜上所述，鈴鐺刺花是一種安全的、有抗疲勞作用的植物，鈴鐺刺花的提取物對提高機體免疫力及運動抗疲勞的作用。