氧化石墨烯對2種海洋微藻的毒性效應研究?

杜樹豪， 孟范平, 張 倩， 彭曉玲

(中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

近20年來，石墨烯基材料(GBMs)的生產(chǎn)和應用因其以下優(yōu)點而發(fā)展迅速[1]：①改善生物材料的機械和電氣性能；②能夠在生物材料表面附著和生長；③可制備更高效的生物傳感器。到2028年年底，預計全球GBMs市場將達到8億美元，較2018年預計增長15倍[2]。常見的GBMs主要包括石墨烯(GS)、氧化石墨烯(GO)和還原型氧化石墨烯(rGO)。GO是石墨烯的氧化物，含有單層并以六元環(huán)排列的sp2雜化碳原子[3]，其分子中含有羧基、羥基、環(huán)氧基等含氧官能團[3-4]而易于分散在水和其它有機溶劑中[3]。目前，GO因其優(yōu)良的導電性能及良好的水溶性已被廣泛應用于電子器件、催化氧化、生物技術以及作為工業(yè)生產(chǎn)中的表面活性劑，成為GBMs市場的最大組成部分[5-8]。同時，GO又是一種碳納米材料(即三維空間中有一維的尺寸小于100 nm)。在GO大量應用過程中，將被釋放到河流、水庫、湖泊和海洋等水環(huán)境中，可能會增加環(huán)境風險水平，因此其生物安全性受到較多關注。

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，微藻作為初級生產(chǎn)者具有重要地位，研究GO對微藻生長的影響及其機制對于評價GO的潛在毒性效應具有重要作用。目前，該方面的研究對象為淡水微藻。Nogueira等[9]研究認為，GO對羊角月牙藻(Raphidocelissubcapitata)生長的抑制可能是活性氧(ROS)產(chǎn)生和膜損傷(細胞活力)的結(jié)果，而GO在培養(yǎng)基中的團聚所引起的遮光效應也會降低藻細胞密度。Hu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，GO濃度≥2.5 mg·L-1時，纖細裸藻(Euglenagracilis)細胞的丙二醛(MDA，逆境脅迫下脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物)含量顯著增加，并認為培養(yǎng)基中的GO以及包覆在藻細胞表面的GO均會引起遮光效應從而降低微藻對光的利用。Zhao等[10]在研究GO對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的致毒機理時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中GO的遮光效應對微藻生長抑制的貢獻率約為16.4%；GO造成細胞膜完整性明顯下降則是由氧化逆境和物理性穿透共同作用所致。然而，目前尚未見到有關GO對海洋微藻毒性的研究報道。已有研究證實，離子強度增大可以促進GO團聚[11]。那么海水背景下GO對微藻的毒性程度和機理可能與淡水環(huán)境有所不同。為此，本研究擬在測定GO對2種海洋微藻(鹽生杜氏藻Dunaliellasalina和海洋微擬球藻Nannochloropsisoceanic)的半抑制濃度(EC50)基礎上，根據(jù)暴露期間微藻的生理學指標(GSH、GPx、GR、GST、MDA、光合色素)以及細胞形態(tài)、超微結(jié)構的變化，分析其致毒機制，為GO的海洋生態(tài)風險評價及其排放控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GO分散液(深棕色，濃度10 000 mg·L-1)：購自中國山東省濟寧利特納米技術有限責任公司，采用改進Hummer’s法合成，pH 5～7，純度>99.9%，單層率>99%，Mn含量小于10 mg·L-1。

微藻：海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanic)購自中國科學院海洋研究所，鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)購自中國海洋大學微藻種質(zhì)庫。兩種微藻均采用F/2培養(yǎng)基[12]進行培養(yǎng)。

海水：取自青島市石老人海域(pH=7.90±0.02、鹽度30)，使用前經(jīng) 0.45 μm 醋酸纖維濾膜抽濾，121 ℃下滅菌20 min后冷卻備用。

試劑：測定蛋白質(zhì)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、丙二醛(MDA)的試劑盒購自南京建成生物工程研究所。1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)、谷胱甘肽(GSH)為Sigma公司產(chǎn)品。NaH2PO4、Na2HPO4、丙酮等試劑均為國產(chǎn)分析純。鄰苯二甲醛(OPT)為國產(chǎn)化學純。

1.2 方法

1.2.1 GO的粒徑測定及其在蒸餾水和培養(yǎng)基中的形態(tài)觀察 分別向蒸餾水和F/2培養(yǎng)基中加入GO分散液，使GO濃度均為100 mg·L-1，超聲(JY92-II型，中國寧波新芝)振蕩1 h后，在激光粒度分析儀(Nano S90型，英國馬爾文公司)上測量GO粒徑；在透射顯微鏡(JEM-2100型，日本電子株式會社)下觀察GO形態(tài)。

1.2.2 微藻生長抑制試驗與72 h半抑制濃度(72 h EC50)計算 在125 mL的F/2培養(yǎng)基中加入GO分散液，使其濃度分別為0、1、10、50、100和150 mg·L-1，每組3個平行，150 W超聲處理1 h后，接種指數(shù)生長期的微藻(初始濃度約5×105cells·mL-1)。培養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃、光強80 μmol·(m2·s)-1、光暗比12 h∶12 h。在定軌振蕩光照培養(yǎng)箱(PGX-250D-LED型，江蘇天翎)中培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)速為100 r/min。每隔24 h，在顯微鏡(YS2-H型，日本尼康)下觀察計數(shù)，計算藻細胞密度(D，106cells·mL-1)，結(jié)果以(平均值±標準差)表示。

繪制每種微藻的72 h生長曲線，按公式(1)計算各處理濃度對應的藻細胞生長抑制百分率(I)，采用概率單位法[13]得到GO濃度對數(shù)(x)—概率單位(y，由百分數(shù)換算得到)的關系方程。當概率單位為5.0時，計算得到72 h EC50。

(1)

式中：I為藻細胞生長抑制百分率；Ac、At分別為對照組、處理組的生長曲線與坐標軸包圍面積。

1.2.3 微藻的掃描電鏡和透射電鏡觀察 在1.2.2節(jié)的暴露培養(yǎng)結(jié)束后，分別吸取對照組和GO100 mg·L-1處理組的藻液，在4 ℃、1 000 r·min-1下離心15 min，藻泥用于掃描電鏡和透射電鏡觀察。

(1)掃描電鏡觀察：用于清晰顯示藻細胞形態(tài)以及GO團聚體在其表面的附著情況。參照Chen等[14]的方法，向藻泥中加入2.5%戊二醛固定，用PBS(pH=7.8，0.1 mol/L)清洗3次；然后用酒精梯度脫水(30%、50%、70%、80%、100%)，每次10 min；干燥后用噴金鍍膜，置于掃描電鏡(SEM，JSM-840型，日本電子株式會社)下觀察。

(2)透射電鏡觀察：按照(1)的步驟將藻泥用戊二醛固定后，在含1%鋨酸的PBS中固定90 min，再用系列濃度的丙酮(10%～100%)逐級脫水。經(jīng)環(huán)氧樹脂滲透、包埋后，用超薄切片機切片和檸檬酸鉛染色，置于透射電鏡(TEM，H-7650型，日本日立公司)下觀察拍照[15]。

1.2.4 GO暴露下微藻的GSH及相關酶、MDA測定 對于1.2.2節(jié)中的對照組和GO濃度為10、100 mg·L-1處理組，培養(yǎng)結(jié)束后分別收集藻液100 mL，于4 ℃、5 000 r·min-1下離心15 min，棄上清液，向藻泥中加入PBS(pH=7.8，0.1 mol·L-1)重懸浮后，用超聲波細胞破碎儀破碎30 min(120 W，間歇、工作各5 s，冰浴)，在4 ℃、1 000 r·min-1下離心15 min，上清液用于以下指標測定。

(1)GSH含量和GST活性測定

GSH：分子熒光光度法[16]。在堿性介質(zhì)中，OPT與氨基酸、肽反應生成熒光化合物，當激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為430 nm時，在一定范圍內(nèi)熒光強度與GSH濃度呈線性關系。根據(jù)GSH濃度-熒光強度標準曲線，計算樣品中的GSH濃度(mg·mL-1)，進而轉(zhuǎn)換為每g組織蛋白中GSH含量，單位為mg/gprot。

GST：參照Habig等[17]的方法。原理為：GST能夠催化GSH與CDNB反應生成1-巰基-2,4-二硝基苯(GS-DNB)。在波長340 nm下，通過測定吸光度變化率計算GST活性。酶活力單位為nmol/(min·mg)prot。

(2)GPx(U/mgprot)、GR活性(U/mgprot)和MDA(nmol/mgprot)、蛋白質(zhì)含量(g·L-1)：均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.2.5 光合色素含量測定 取1.2.2節(jié)培養(yǎng)結(jié)束后的對照組和GO濃度10、100 mg·L-1處理組藻液各2 mL，2 500 r·min-1離心15 min，棄上清液后，加入2 mL 80%的丙酮，黑暗處抽提24 h，再以2 500 r·min-1離心15 min，取上清液測定663、646和470 nm處的吸光值(OD)，根據(jù)公式(2)～(5)[18]計算葉綠素a(Chla)，葉綠素b(Chlb)，總?cè)~綠素(Chl(a+b))和類胡蘿卜素(Car)含量，單位為μg·(106cells)-1)。公式中，D為藻細胞密度(106cells·mL-1)：

(2)

(3)

(4)

(5)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在GO對微藻的生長抑制試驗和毒理學試驗中，每個處理組及對照組各設置3個重復，結(jié)果以3個重復實驗值的(平均值±標準差)表示。通過單因素方差分析(ANOVA)及Tukey’s post-hoc多重比較檢驗，進行差異顯著性分析，統(tǒng)計顯著性水平為p<0.05，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 18.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO的粒徑分布及其在培養(yǎng)基中的形態(tài)

由圖1(A)可見，GO在純水中分散均勻，呈薄片狀，無團聚現(xiàn)象；但是，在離子強度較高的F/2培養(yǎng)基(介質(zhì)為海水)中，GO出現(xiàn)嚴重團聚現(xiàn)象，顏色加深(見圖1(B))。粒度分析結(jié)果表明，本研究所用GO的粒徑大多處于200～400 nm之間(見圖1(C))。

圖1 GO在蒸餾水(A)、F/2培養(yǎng)基(B)中的TEM圖以及GO的粒度分布圖(C)Fig.1 TEM images of GO in in distilled water (A) and F/2-medium (B) respectively after sonication and particle size-distribution in distilled water (C)

2.2 GO對2種微藻生長的抑制

由圖2可見，GO對2種微藻的生長均具有明顯抑制作用，其中，鹽生杜氏藻在含GO的培養(yǎng)基中暴露24 h期間幾乎無法生長。隨著暴露時間延長，較高濃度GO對微藻生長的抑制效應越來越大。暴露72 h時，150 mg·L-1處理組中，鹽生杜氏藻的細胞密度(0.652×106cells·mL-1)僅為同期對照組(1.457×106cells·mL-1)的44.75%；同樣，海洋微擬球藻的細胞密度(1.987×106cells·mL-1)降為同期對照組(4.671×106cells·mL-1)的42.54%。根據(jù)微藻生長曲線，采用1.2.2節(jié)的方法，計算得到GO對2種微藻的72 h EC50值分別為13.04 和79.10 mg·L-1(見表1)。

2.3 微藻的GSH及其相關酶對GO暴露的響應

圖3顯示，2種微藻暴露于低(10 mg·L-1)、高濃度(100 mg·L-1)的GO 72 h后，與對照組相比，GSH含量均降低，其中，鹽生杜氏藻的降幅分別為50.0%和71.3%，海洋微擬球藻的降幅分別為58.4%和62.0%。GPx活性也受到抑制，其中，鹽生杜氏藻的降幅分別為21.4%和20.9%，海洋微擬球藻的降幅分別為43.1%和48.2%。但是，高濃度GO暴露則顯著誘導微藻的GR、GST活性，鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻的GR活性分別比對照組上升38.3%和178%；GST活性分別增加95.6%和142%。

2.4 微藻的脂質(zhì)過氧化程度

由圖4可見，72 h暴露試驗中，低濃度(10 mg·L-1)的GO對2種海水微藻MDA含量的影響不顯著，而暴露在高濃度(100 mg·L-1)GO后，微藻的MDA含量發(fā)生顯著變化(p<0.05)。與對照組相比，鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻的MDA含量分別增加18.0和10.9倍。

表1 GO對2種海洋微藻的72 h EC50Table 1 72 h EC50 values of GO calculated for two species of marine microalgae

圖2 鹽生杜氏藻(A)和海洋微擬球藻(B)在不同濃度GO中暴露的生長曲線Fig.2 Growth curves of Dunaliella salina and Nannochloropsis oceanic in batch cultures as a function of GO concentration

2.5 微藻的光合色素含量

不同濃度(0、10、100 mg·L-1)GO暴露72 h后，2種微藻光合色素含量的變化見圖5。無論GO存在與否，鹽生杜氏藻的3種光合色素含量均高于海洋微擬球藻。對于鹽生杜氏藻，與對照組相比，2種濃度的GO處理均能顯著刺激光合色素合成(p<0.05)，且濃度較高(100 mg·L-1)處理組的增幅大于濃度較低(10 mg·L-1)處理組(Chla：79.9% vs. 37.6%；Chlb: 89.5% vs. 36.8%；Chl(a+b): 82.8% vs. 37.3%；Car: 56.5% vs. 32.5%)。對于海洋微擬球藻，較低濃度GO也能引起色素含量顯著增加，其中，Chla和Car的變化達到顯著水平(p< 0.05)；較高濃度GO能顯著誘導除Car(降幅為48.2%)以外的其它色素的合成(p< 0.05，增幅分別為：Chla11.7%、Chlb81.1%和Chl (a+b) 41.5%)。

2.6 微藻表面形態(tài)與微觀結(jié)構

SEM觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻近似呈球形(見圖6 (A)、(D))，經(jīng)過GO暴露后，細胞因外部包覆一層GO而呈不太規(guī)則的球形或其它形狀(見圖6 (B)、(C)、(E)、(F)中黃色箭頭所指)，且藻細胞總體呈皺縮狀態(tài)，海洋微擬球藻尤為明顯(見圖6 (E)、(F))。

TEM圖顯示，對照組的藻細胞近似為圓形，細胞膜和細胞壁完整(注：鹽生杜氏藻無細胞壁)，細胞核、葉綠體、線粒體、高爾基體以及淀粉粒、油脂小球等清晰可見(見圖7 (A)、(C))。暴露于GO后，可觀察到以下4點明顯變化：①2種微藻的細胞形態(tài)發(fā)生畸變(與SEM觀察結(jié)果相符)，其中，鹽生杜氏藻的部分細胞膜結(jié)構受到破壞，內(nèi)容物外泄(見圖7 (B)中黃色箭頭所指)；海洋微擬球藻細胞則變得細長(見圖7 (D))，細胞表面還出現(xiàn)一些凸起(見圖7 (B)、(D)中紅色箭頭所指)；②鹽生杜氏藻細胞核嚴重變形，核膜模糊不清，核質(zhì)發(fā)生凝聚(圖7 (B)中藍色箭頭所指)；③海洋微擬球藻的細胞質(zhì)中分布著GO顆粒(見圖7(D)中2處藍色箭頭指示的黑色陰影處)；④藻細胞內(nèi)的淀粉粒數(shù)量增多(或體積增大)(見圖7 (B)、(D))。

(*p<0.05水平上差異顯著。* denotes significant difference from the control at p<0.05.)

(*p<0.05水平上差異顯著。*denotes significant difference from the control at p<0.05.)

3 討論

GO對微生物的生長抑制情況因微生物種類而異。根據(jù)我國《新化學物質(zhì)危害評估導則》(HJ/T 154—2004)[19]提出的生態(tài)毒理學危害性分級標準，GO對2種海洋微藻(鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻)均具有中等毒性(72 h EC50介于10～100 mg·L-1)，但是，鹽生杜氏藻對GO的敏感性高于海洋微擬球藻(72 h EC50：13.04 mg·L-1vs. 79.10 mg·L-1)，也高于除纖細裸藻(Euglenagracilis)以外的其它淡水藻種(72 hEC50≥20.6 mg·L-1，見表1)。但是，由于目前國內(nèi)外關于GO毒性效應的研究所涉及的微藻種類較少，尚無法判斷海洋微藻與淡水微藻對GO敏感性的相對高低。

本研究觀察到GO-微藻體系中幾乎所有藻細胞的表面都有GO聚集體附著，甚至整個細胞被GO完全包裹(見圖6)，這是因為GO表面存在羧基、羥基和烷氧基[22-23]，而微藻細胞壁上含有多糖、蛋白質(zhì)、脂類等[24]，其細胞膜則是由磷脂分子層、糖脂和蛋白質(zhì)組成[25-26]，這些生物大分子中富含酰胺基、羧基、羥基等官能團[32]，使得GO與海洋微擬球藻、鹽生杜氏藻(無細胞壁)之間容易通過形成氫鍵和共價鍵而結(jié)合。光是影響微藻生長最重要的環(huán)境因子之一。理論上，在海水中透光性變差(因顏色加深)的GO包覆于藻細胞表面后，必然造成入射到藻細胞內(nèi)的光強減弱，相應的，光合作用會降低。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，2種微藻暴露于高、低濃度GO后，單位數(shù)量藻細胞的光合色素含量總體上明顯增加(見圖5)。Metzler等也發(fā)現(xiàn)[27]，納米顆粒產(chǎn)生的遮光效應在減少藻細胞對光吸收的同時會導致葉綠素含量增加，并認為這種變化是微藻對遮光效應的一種應激響應，其目的是優(yōu)化光的利用率，增加藻細胞對光的吸收，以消除遮光(非完全不透光)帶來的不利影響。即便如此，由于微藻可獲得的光強減少，其光合作用強度并不能達到對照組水平，表現(xiàn)為微藻生長受到抑制(見圖2)。

(*p<0.05水平上差異顯著。*denotes significant difference from the control at p<0.05.)圖5 2種微藻暴露于GO(0、10和100 mg·L-1)72 h后的Chl a、Chl b、Chl (a+b)和Car含量Fig.5 Contents of Chl a, Chl b, Chl (a+b) and Car in two species of algae exposed to 0, 10 and 100 mg·L-1 of GO for 72 h

(A～C：鹽生杜氏藻；D～F：海洋微擬球藻。其中，黃色箭頭指示GO包裹細胞。A～C:Dunaliella salina; D～F: Nannochloropsis oceanic. The yellow arrows indicate GO envelops cells.)

雖然海洋微擬球藻具有細胞壁，但是包覆于其表面的GO仍能進入細胞質(zhì)中(見圖7(D))。細胞壁是外部物質(zhì)進出藻細胞的主要部位和屏障。據(jù)報道，細胞壁上的微孔直徑在5～20 nm之間，因此細胞對外部物質(zhì)的進出具有選擇性[28]。本研究所用的GO在淡水中的粒徑大多在200～400 nm(見圖1)。當GO進入F/2培養(yǎng)基(海水介質(zhì))后，其表面電荷因高濃度電解質(zhì)的屏蔽效應而減少，膠體的穩(wěn)定性變差[29]，造成GO團聚而形成較大的聚集體，故其粒徑必然大于淡水中的粒徑。在這種情況下，GO進入海洋微擬球藻細胞內(nèi)的原因可能是：細胞繁殖期間細胞壁的通透性會發(fā)生改變，使得一些大尺寸的納米顆粒聚集體能夠穿過新合成的細胞壁[30]，而后通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用(真核細胞中普遍存在)進入細胞內(nèi)[31]。鹽生杜氏藻細胞的表面缺少細胞壁，意味著海水介質(zhì)中的GO可以直接與細胞膜接觸，而GO片層的邊緣通常較為尖銳(單層GO的厚度約為0.8～1 nm)，其與細胞的相互碰撞過程可直接刺穿細胞膜，造成細胞完整性的喪失[32-33]，這將大大降低GO進入藻細胞的阻力。因此，在TEM圖像中觀察到暴露于GO的鹽生杜氏藻細胞形態(tài)嚴重畸變、細胞膜破損、內(nèi)容物外泄、細胞核染色質(zhì)凝集等。而經(jīng)同樣GO暴露后的海洋微擬球藻中較少見到這些變化(見圖7 (B)、(D))。這是鹽生杜氏藻生長受GO抑制較大的原因之一。文獻報道無細胞壁的淡水微藻纖細裸藻對GO具有高敏感性(72 h EC50= 3.76 mg·L-1)，也能夠證明這一點。

碳納米材料在藻細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化逆境常被認為是此類物質(zhì)的致毒機理之一。大量研究已證明，碳納米顆粒能在生物體內(nèi)誘導ROS產(chǎn)生[34-35]，其中，GO對ROS生成具有顯著催化作用，由此引發(fā)脂質(zhì)過氧化，造成細胞壁以及DNA等生物分子的氧化損傷，抑制細胞的生理行為而導致毒性[31,36]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露于GO的2種微藻細胞內(nèi)谷胱甘肽抗氧化防御系統(tǒng)出現(xiàn)顯著變化。其中，GSH含量顯著降低(p<0.05)，表明這種抗氧化劑在消除ROS過程中被大量消耗。一般認為[32,37]，GSH可通過2條途徑起到抗氧化作用，一是在GPx催化下與H2O2作用生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)；二是在GST作用下與污染物結(jié)合成為極性小的物質(zhì)，實現(xiàn)對機體的保護作用。此外，細胞中的GR可利用NADPH作為電子供體，催化GSSG的二硫鍵還原，重新生成GSH，以維持細胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡。就本研究而言，由于高、低濃度GO暴露下GPx活性均顯著受抑(p<0.05)，而GST活性未受到抑制甚至在高濃度GO處理組中顯著上揚(見圖3)，表明GSH在GPx催化下清除H2O2而消耗的數(shù)量相對較少，相反，因與GO直接結(jié)合而消耗的GSH數(shù)量較大(雖然兩者的結(jié)合機制尚不清楚)。相應的，高濃度GO暴露下活性顯著上升的GR(p<0.05)只能對GSSG進行還原，而無法介入與GO直接結(jié)合的GSH的恢復，由此導致GO處理組的GSH含量始終低于對照組(見圖3)。

(紅色箭頭指向細胞表面凸起，藍色箭頭指向核染色質(zhì)凝集，黑色箭頭指向進入細胞內(nèi)部的GO。Cw：細胞壁；CE：細胞外膜；Pm：質(zhì)膜；N：細胞核；M：線粒體；CHL：葉綠體；PC：淀粉核中心；Psp：淀粉鞘；S：淀粉粒；L：油脂小球；Cc：凝集的核染色質(zhì)；G：高爾基體。The red arrows indicate the cell surface bulge, blue arrows indicate the Nuclear chromatin agglutination, and black arrows indicate the internalized GO. Cw： cell wall; CE： cell envelope;Pm： plasmalemma; N： nucleus; M： mitochondrion; CHL： chloroplast; PC： pyrenoid center; Psp： pyrenoid starch plate; S： starch grain; L: lipid globule;Cc： condensed chromatin; G： golgi apparatus.)

表2 GO對不同種類微藻的生長抑制作用(EC50)比較Table 2 Growth inhibition effects (EC50) comparison of GO to the different algal species

比較發(fā)現(xiàn)，在較高濃度GO脅迫下，鹽生杜氏藻的GR活性誘導程度較小，GSH剩余量也較低，表明其對ROS的清除能力不及海洋微擬球藻。相應的，該微藻細胞內(nèi)出現(xiàn)較高含量的MDA(見圖4)，這是過多積累的ROS攻擊生物大分子造成嚴重脂質(zhì)過氧化的結(jié)果。暴露于GO的鹽生杜氏藻中出現(xiàn)的細胞膜明顯破損、核膜模糊不清等現(xiàn)象(見圖7)也與此有關。至于2種海洋微藻細胞內(nèi)的淀粉積累量增加(見圖7 (B)、(D))，則是微藻對GO脅迫的一種適應機制。很多研究已證實[38,39]，在氮磷營養(yǎng)鹽不足、高鹽度等生長逆境下，藻細胞會將光合作用固定的碳源更多用于儲能物質(zhì)(淀粉或脂質(zhì))積累，以抵御外界環(huán)境變化和實現(xiàn)機體自我保護。

4 結(jié)論與展望

(1)GO對鹽生杜氏藻和海洋微擬球藻生長均有抑制，72 h EC50分別為13.04和79.10 mg·L-1。

(2)GO不會抑制海洋微藻光合活性，卻能促進微藻光合色素合成，并以淀粉粒形式積累。

(3)GO暴露引起微藻谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)明顯變化，包括GSH大量消耗、GPx活性受抑、GST和GR活性上揚。高濃度GO脅迫下細胞內(nèi)MDA含量激增，脂質(zhì)過氧化嚴重。

(4)鹽生杜氏藻對GO的高敏感性與其缺少細胞壁以及GSH過度消耗有很大關系。

(5)本研究結(jié)果有助于人們加深對GO海洋生態(tài)效應的認識，今后應采用更多海洋微藻進行研究，并探討環(huán)境因子對GO毒性的影響，為客觀評價GO的海洋生態(tài)風險提供充分依據(jù)。