脂肪組織來源細胞再生技術在整形修復領域中的研究進展

黃蓉，范金財

(中國醫學科學院 北京協和醫學院整形外科醫院整形九科，北京 100144)

脂肪移植在臨床的應用達100多年，1893年有學者在第23屆德國外科年會上報道了第一例成功的脂肪移植，將小塊脂肪組織移植用于面部軟組織缺損的矯正[1]。20世紀80年代，Illouz[2]引入吸脂技術抽取脂肪，使脂肪移植得到了進一步的發展。而后，Coleman[3]對脂肪移植技術進行了改進。傳統的脂肪移植分為兩類，即大脂肪細胞團移植和細小脂肪細胞團移植，兩者的脂肪顆粒大小雖然有區別，但均含有成活的脂肪細胞[4-5]。2001年，Zuk等[6]首次在脂肪組織中分離出間充質干細胞，與骨髓中分離出的干細胞相似，稱為脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，ADSCs成為再生醫學中的研究熱點。隨后，Matsumoto等[7]發現，從脂肪組織中分離出的基質血管成分(stromal vascular fraction，SVF)可提高脂肪移植物的存活率，繼而開發了細胞輔助脂肪移植技術，標志著自體脂肪細胞移植的開端。2013年，Tonnard等[8]提出了納米脂肪移植的概念，發現細針頭注射納米脂肪不僅可治療面部淺表皺紋等問題，還具有巨大的再生潛能。近年來，脂肪組織來源細胞再生技術在整形修復領域得到了廣泛應用。現就脂肪組織來源細胞再生技術在整形修復領域中的研究進展予以綜述。

1 脂肪組織來源細胞的分類

1.1納米脂肪及其衍生物 納米脂肪大小為400～600 μm，甚至更小。2013年，Tonnard等[8]首次報道了納米脂肪，制備方法為：先用側孔直徑為1 mm的吸脂針抽吸脂肪，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗，然后進行機械乳化，即在2個10 mL注射器間將抽取到的顆粒脂肪反復來回推注30次，最后用0.5 mm孔徑的尼龍紗布過濾。此后，諸多學者在Tonnard法的基礎上，對納米脂肪制備過程進行調整，從而得到不同的細胞產品。Lo Furno等[9]省略制備納米脂肪的最后一個步驟——過濾，其他制備流程不變，設計制備了二代納米脂肪，比較兩種納米脂肪中ADSCs的細胞活性、密度以及增殖率的差異，結果發現，二代納米脂肪中ADSCs的水平更高。同樣，為了提高ADSCs水平，Pallua等[10]在Tonnard法基礎上分別在機械乳化的前后各增加1次離心，并將最終產物命名為脂肪濃縮物，結果發現，脂肪濃縮物中的確含有高濃度的ADSCs和內皮祖細胞。Gu等[11]在制得納米脂肪后，再將其以3 000 r/min速度離心3 min，以去除油層和水分，進而得到濃縮納米脂肪。脂肪移植后存活率較低是困擾整形外科醫師的難題，為提高移植后脂肪存活率，Bi等[12]首先通過Ⅰ型膠原酶化學消化，再進行離心，從而避免了機械乳化對納米脂肪內脂肪細胞活性的破壞，最終獲取脂肪產物——納米活性脂肪，經過對比發現，納米活性脂肪的吸收率低于納米脂肪。Zheng等[13]提出了脂肪提取物的概念，將納米脂肪以1 200 r/min離心5 min，發現脂肪提取物既可促進新生血管形成，也可通過減少細胞內活性氧類的堆積實現脂肪提取物對脂肪細胞的抗凋亡作用，從而提高脂肪移植存活率。結合脂肪提取物和納米活性脂肪在提高脂肪存活率中的積極作用，脂肪提取物或納米活性脂肪聯合脂肪細胞移植可能成為一種具有臨床應用潛力的新技術。

以上改良版納米脂肪的初衷大多是提高納米脂肪中ADSCs或SVF水平，實驗室研究或臨床應用也證實了制備方式的改變對納米脂肪特性及臨床效果的積極影響，但目前隨機對照試驗較少，證據等級較低，很難明確它們的實際療效。此外，Stuzin[14]認為，“納米脂肪”這一專業術語的準確性值得懷疑，Tonnard方法制備的納米脂肪并未達到納米級，將其稱為超微米脂肪更為準確。

1.2SVF SVF是從皮下脂肪提取的去除白色脂肪細胞的細胞群，包括內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、淋巴細胞以及大量間充質干細胞等，但不含脂肪細胞[15]。目前制備SVF常用的方法包括酶消化法和機械乳化法。酶消化法是指用含有膠原酶的緩沖液在37 ℃環境下消化脂肪，消化時間因研究人員的習慣而各有不同，膠原酶可破壞細胞外基質的膠原纖維，一旦開始分離出不同的細胞成分，即對酶消化后的產物進行離心分離，最后獲取的提取液可分為三層，其中最下層的沉淀即為SVF[16]。機械乳化法是指Tonnard制備納米脂肪所采用的方法，SVF與納米脂肪的成分基本一致，稍有不同的是納米脂肪內包含破碎的脂肪細胞碎片；不含酶的機械分離法在干細胞分離中的效率大大降低，且不同設備制得的SVF中干細胞和殘留酶存在巨大差異[17]。盡管臨床經驗證明了注射膠原酶的安全性，但謹慎起見，仍應在回注前從細胞制劑中去除所有可測量的活性酶。由于SVF無需體外擴增而含有干細胞，被視為細胞再生的理想材料[18]。

1.3ADSCs ADSCs是間充質干細胞的一種。ADSCs 可分化為多個胚胎譜系，其中最重要的是中胚層譜系[19]。ADSCs不僅可分化為多種類型細胞，還具有重要的旁分泌特性，通過信號通路的調節減少瘢痕組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動蛋白的表達[20]。ADSCs的旁分泌作用還可減少紫外線誘導的細胞凋亡，縮短人真皮成纖維細胞的亞G1期[21]。目前尚未鑒定出ADSCs的單一標記，國際再生治療學會認為，CD73、CD90和CD105是表征間充質干細胞的最低標準[22]。目前國內外尚缺乏生產ADSCs的標準流程和質量管理規范，導致ASDCs的應用面臨極大制約。目前推薦的制備ADSCs的方法是用酶消化脂肪抽吸物，然后離心得到SVF，接種SVF至培養瓶中，設定培養條件為5%CO2、37 ℃，進行常規培養，保持濕度；細胞融合度達到70%～80%時可以傳代，收集消化的細胞懸液，接種至培養瓶中，隨后進行傳代培養[23]。

與制備而來的純粹的ADSCs相比，SVF的特點是不僅包含ADSCs，還包含內皮祖細胞、造血祖細胞和白細胞等其他細胞類型[24-25]，但不含脂肪細胞。而納米脂肪的特點為不僅包含與細小脂肪細胞團數量相當的ADSCs，還包括破碎的脂肪細胞以及其他脂肪組織的基質成分[12]。由此看來，SVF和納米脂肪成分基本一致，稍有不同的是納米脂肪內雖無活的脂肪細胞，但包含破碎的脂肪細胞碎片。

2 臨床應用和實驗室研究

2.1減輕瘢痕 導致瘢痕的常見原因有外傷、手術等，一直以來瘢痕治療受各種因素的限制，治療效果欠佳。實驗研究發現，生長因子可通過調節成纖維細胞增殖抑制膠原合成，實現抗纖維化，而重要的調節因子包括細胞外基質中的基質金屬蛋白酶以及金屬蛋白酶組織抑制劑[26]。ADSCs可合成和分泌細胞因子，為脂肪組織來源細胞再生技術應用于瘢痕治療提供了理論基礎。Tenna等[27]選擇30例面部萎縮性痤瘡瘢痕患者作為研究對象，給予皮下注射納米脂肪聯合富血小板血漿，結果顯示，無論是否聯合應用CO2激光，納米脂肪聯合富血小板血漿皮下注射均具有積極的臨床療效。Uyulmaz等[28]應用納米脂肪治療40例外傷導致的瘢痕患者，具體瘢痕類型不詳，治療后患者滿意度達92%。然而，目前納米脂肪中減輕瘢痕的成分尚不明確，需進一步研究將潛在的ADSCs介導的作用與其他因素分開。另外，在一組前瞻性病例研究中，Gu等[11]應用濃縮納米脂肪聯合結構脂肪治療20例患者(共計25例面部萎縮性瘢痕)，患者與觀察者瘢痕評估表評分顯示，患者對術后瘢痕改善效果滿意，且組織學檢測發現術前不存在皮脂腺和汗腺的瘢痕組織在注射后出現了皮脂腺和汗腺，推測可能是濃縮納米脂肪中的ADSCs促進了皮脂腺和汗腺再生，促使瘢痕組織向正常皮膚轉化。Gentile等[29]將Tonnard法納米脂肪和三種改良納米脂肪進行比較，并將四種納米脂肪應用于43例燒傷或創傷后瘢痕患者，結果發現，增壓改良的納米脂肪中SVF水平最高，經過團隊評估和患者自評后發現，增壓改良的納米脂肪可減輕瘢痕，臨床評價最佳，且納米脂肪中SVF水平與臨床療效呈正相關。動物實驗中，Zhang等[30]在增生性瘢痕模型的兔耳內注射ADSCs，發現ADSCs可通過減少α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原基因的表達，改善膠原蛋白沉積，減輕兔耳增生性瘢痕的形成。

脂肪組織來源細胞再生技術在減輕瘢痕的應用中作用顯著，但由于很難確定每種再生技術的有效劑量，無法并列比較它們臨床作用的優劣。但多項對比研究顯示，瘢痕效果的改善與SVF水平密切相關，相較于ADSCs，SVF的臨床效果更佳[16，31-32]。ADSCs單獨應用時不具備體積填充的作用，因此不適用于凹陷型瘢痕等瘢痕類型的治療，而納米脂肪及SVF因富含ADSCs，可起到糾正輕微體積缺損等作用，因而應用范圍更廣泛。調整納米脂肪的制備程序后發現，納米脂肪制備中任何一個步驟的改變均可影響SVF的水平，繼而改變臨床效果[29]，提示未來應進一步詳細分解納米脂肪制備過程，在制備流程簡易化的同時尋求SVF的高產量。此外，Vallejo等[33]認為，脂肪填充時由于脂肪內的ADSCs具有旁分泌等作用，可能會干擾腫瘤生物學，因此將脂肪填充應用于惡性腫瘤切除術后的瘢痕患者時，難以排除ADSCs由于分泌生長因子等而引起腫瘤復發的可能。而鑒于ADSCs是脂肪組織來源細胞再生技術的核心成分，研究者應針對ADSCs對腫瘤生物學的影響加強基礎研究，明確脂肪組織來源細胞再生技術的禁忌證。

2.2面部年輕化 皮膚老化主要表現為皺紋、色素沉著、皮膚松弛萎縮等，這些表現主要由內在因素(基因、激素)和外在因素(紫外線、吸煙)等共同造成[34]。脂肪組織來源細胞再生技術可促進膠原蛋白重新合成，減少彈性組織變性。Tonnard等[8]應用納米脂肪注射治療67例患者的淺表皺紋，療效顯著且術后未見感染、脂肪囊腫等并發癥，僅在大面積注射部位出現短暫紅斑，但僅持續1.5～2 d，提示納米脂肪可促進正常的真皮和表皮基質結構的恢復；另外，應用納米脂肪治療黑眼圈也取得了良好的效果。然而，考慮到不同分型黑眼圈病因有所不同，李聰等[35]認為，納米脂肪僅對血管性黑眼圈和部分結構性黑眼圈療效顯著，而對于色素性黑眼圈以及混合型黑眼圈療效有限。

Wei等[36]比較了62例聯合應用納米脂肪、富血小板纖維蛋白和結構脂肪移植的試驗組患者和77例接受傳統自體脂肪移植的對照組患者，結果發現，納米脂肪參與的試驗組面部軟組織凹陷癥狀和皮膚質地均較傳統脂肪移植組有較大改善，納米脂肪組總體滿意率達90%以上，且移植區脂肪組織長期存活，多數患者無須多次重復注射。隨后，Liang等[37]比較了接受納米脂肪和皮內富血小板纖維蛋白聯合注射的103例面部皮膚老化患者和接受透明質酸注射的128例面部皮膚老化患者的治療效果，結果顯示，接受納米脂肪和皮內富血小板纖維蛋白聯合注射的患者面部皮膚老化的改善大于接受透明質酸注射者，考慮可能是富血小板纖維蛋白可持續釋放生長因子，刺激ADSCs的增殖和旁分泌功能，增加了真皮生長因子的濃度。Amirkhani等[34]給16例患者的鼻唇溝注射了自體SVF，并評估注射后鼻唇褶的改善情況，結果發現，SVF治療后皮膚真皮密度和厚度均顯著增加；值得注意的是，注射后1周內并未檢測到注射細胞，表明SVF的旁分泌機制主要負責真皮結構的變化，而并不參與構成組織的結構成分，由此推測，SVF治療效果的一個潛在機制可能是補充CD44，CD44是一種透明質酸受體，CD44的減少與皮膚老化相關，可導致真皮層密度降低。

在動物實驗中，Zheng等[38]成功建立光老化裸鼠模型，并將每只小鼠背部分為4個區域，隨機注射傳統納米脂肪、離心后中間層納米脂肪、離心后下層納米脂肪或0.9%氯化鈉注射溶液，結果發現，離心后下層納米脂肪中SVF及ADSCs的濃度最高，改善小鼠光老化效果最佳。由于納米脂肪和SVF中均不含成活的脂肪細胞，目前面部年輕化的進展得益于再生醫學中的干細胞移植技術。雖然脂肪組織來源細胞再生技術對面部年輕化具有積極療效，但從脂肪組織中分離ADSCs和SVF涉及酶消化，需對其生產過程嚴格監管。與ADSCs和SVF相比，納米脂肪注射除了具備再生潛能，還具有嘴唇、眼瞼等精細部位的體積填充作用，因此在面部年輕化領域中的應用備受矚目。

3 小 結

納米脂肪、SVF、ADSCs等脂肪組織來源細胞均具有強大的組織再生和修復能力。與面部老化的其他治療方法相比，脂肪組織來源細胞再生技術可更好地主動預防衰老并維持療效。三種細胞再生技術各具特點，但與制備SVF和ADSCs的復雜操作以及高昂的制備費用相比，納米脂肪因制備過程簡單、便捷，無化學試劑及酶污染風險而格外具有優勢[14]。目前由于缺乏標準的脂肪組織來源細胞的命名法，且療效評估方法較為多樣，導致脂肪組織來源細胞再生技術的臨床應用受到諸多限制。此外，脂肪組織來源細胞再生技術在減輕瘢痕、促進面部年輕化等方面的作用機制尚不明確，未來仍需進一步研究。