平頦海蛇毒鼠源單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建

杜 宇,張皓冰,楊宇琪,汪 妍,趙紅燕,林熾賢

(1.海南熱帶海洋學院 a.水產與生命學院;b.海南省兩棲爬行動物研究重點實驗室,海南 三亞 572022;2.杭州師范大學 生命與環境科學學院,杭州 311121)

0 引言

單鏈抗體又稱單鏈抗體可變區片段(Single-chain antibody variable fragment,ScFv)，是一類極具潛力的基因工程抗體，分子量小、特異性強及異源性低的特點使其能精準地與抗原結合，與傳統方法制備的抗體相比，還能有效降低對機體的過敏反應[1-2].目前，制備單鏈抗體的方法多為將單鏈抗體基因通過體外重組插入載體，轉化至大腸桿菌中大量擴增和表達，大大增加基因的拷貝，使得篩選優良單鏈抗體基因更加簡便[3-6].單鏈抗體研制已經成為當前研究的熱點，相關技術也已十分成熟.其中，噬菌體展示技術可以將表型和基因型有機地聯系在一起，不經人體免疫和雜交瘤技術便可實現體外篩選富集，可直接制備人源化基因工程抗體，也可通過改造實現非人源化抗體基因的人源化，是當前被廣泛研究和運用的單鏈抗體研制技術[7-9].

本研究以平頦海蛇(Hydrophiscurtus)蛇毒免疫小鼠，通過誘導其產生免疫應答以獲取脾臟總RNA并構建cDNA文庫，利用PCR技術擴增抗體重鏈(VH)可變區和輕鏈(VL)可變區基因片段并拼接成ScFv基因，重組至噬菌體并轉化TG1敏感菌，用輔助噬菌體侵染建立蛇毒蛋白抗體ScFv噬菌體文庫，最終從文庫中初步篩選獲得陽性克隆.該研究的成功可為繼續制備性能穩定、特異性強、親和力高和效能多樣的鼠源性單鏈小分子抗體及其人源化改造提供基礎.

1 材料與方法

1.1 蛇毒與試劑

本實驗用的平頦海蛇毒凍干粉為本實驗室自有制品.弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司；cDNA反轉錄試劑盒和Taq酶購自Abm公司；核酸提取試劑盒、質粒制備試劑盒、PCR清潔試劑盒、Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶、載體和T4連接酶購自TakaRa公司；TG1菌株和M13K07輔助噬菌體購自GE公司；氨芐、卡那霉素、感受態細胞、LB培養基粉及其他分析純試劑均購自上海生工.所有引物合成及測序皆由上海生工完成.

1.2 小鼠免疫

選擇2只10周齡Balb/c小鼠用于蛇毒免疫.稱取足量可供整個免疫過程所需的平頦海蛇毒凍干粉，用生理鹽水配制成10 g·L-1母液，用0.22 μm針式濾頭過濾，隨后保存于-20 ℃冰箱中備用.按照0.02 μg·g-1的蛇毒劑量對小鼠進行首程免疫，免疫前吸取足量母液至1.5 mL離心管，于90 ℃水浴30 min滅活，后加入等體積的弗氏完全佐劑，乳化徹底后按每只300 μL的劑量腹腔注射小鼠.第2～3周按照0.05 μg·g-1和0.1 μg·g-1的劑量分別進行2次加強免疫，滅活后蛇毒用弗氏不完全佐劑乳化，注射方式同首程免疫.

1.3 小鼠脾臟總RNA提取及cDNA反轉錄

第2次加強免疫7 d后，摘取小鼠新鮮脾臟，于液氮預冷的研缽中快速研磨至粉末狀，按照核酸提取試劑盒操作方法提取脾臟總RNA.檢測總RNA的純度及濃度達到要求后，按照5×All-In-One RT MasterMix 試劑盒說明書去除基因組DNA并反轉錄cDNA第1鏈.

1.4 單鏈抗體基因構建

以cDNA為模板，分別擴增重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)片段[8-9].所用引物為：重鏈上游引物TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC，重鏈下游引物AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG；輕鏈上游引物CCGTTTGAT-TTCCAGCTTGGTGCC，輕鏈下游引物GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA；linker引物GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACTCGAGTGG與TGGAGACTGG-GTGAGCTCAATGTCCTGTGCACT；帶內切酶位點全長ScFv基因的上游引物GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC，下游引物GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG.反應體系為：DNA模板0.8 μL，引物各0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水補至20 μL.反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火55 s，72 ℃延伸70 s，共30次循環；72 ℃再延伸10 min.用 1%瓊脂糖凝膠檢測擴增產物.純化 PCR 產物連接 PMD-19T 載體，連接體系為10 μL，連接好的克隆載體轉化感受態細胞 DH5α，涂布到氨芐青霉素濃度100 mg·L-1的平板上，37 ℃培養過夜后，挑取單菌落搖菌擴增.以測序成功的VH和VL質粒與相匹配的linkerDNA 三者互為模板.采用重疊延伸拼接 PCR(SOE-PCR)重組為單鏈抗體片段(ScFv)，反應體系為：質粒各0.8 μL，linkerDNA 1.6 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水加至20 μL.反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火55 s，共7次循環后，72 ℃延伸10 min，將VH和VL拼接為ScFv.

在ScFv基因的5'和3'端分別引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點，設置反應體系為：RS引物混合物0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水加至20 μL.反應條件為：94 ℃變性1 min，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸10 min，25次循環后，再72 ℃延伸10 min.得到單鏈抗體片段后，連接轉化至DH5α，涂布平板，培養過夜.挑取陽性菌落經質粒抽提后送檢測序.

1.5 單鏈抗體基因重組與轉化

用限制性內切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ對測序成功的質粒進行雙酶切消化，反應體系：質粒1 μg，10×QuickCut Buffer 5 μL，Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶各1μL，加水補足至50 mL.吹吸混勻后于37 ℃水浴孵育30 min，再轉移至50 ℃孵育30 min.產物經純化后與同樣酶切后的載體pCANTAB-5E以摩爾比3︰1進行連接，反應體系：10×連接緩沖液2 μL，pCANTAB-5E 50 ng，T4 DNA連接酶1 μL，用滅菌水補足至20吹吸混勻后置于16 ℃連接過夜.

取20 μL上述重組產物與40 μL TG1敏感菌混勻，冰上放置45 min，42 ℃ 2 min，再迅速轉移至冰上放置2 min；后加入190 μL 2×YT培養基于37 ℃培養1 h.隨后鋪SOBAG板，30 ℃過夜，以未轉化的TG1為對照.

1.6 單鏈抗體庫擴增與篩選

用2×YT培養液洗SOBAG板上的轉化克隆，并在37 ℃搖床培養至OD600達到0.4后加入M13K07輔助噬菌體，37 ℃搖床繼續培養1 h.隨后，培養液離心(4 000 r·min-1， 4 ℃，10 min)后去上清，用2×YT-AK(含100 mg·L-1氨芐青霉素和50 mg·L-1卡那霉素)培養液重懸沉淀后于37 ℃搖床培養過夜.培養液在4 ℃條件下10 000 g離心10 min，取上清，加入1/5體積的PEG/NaCl(20%聚乙二醇6000，2.5 mol·L-1氯化鈉)，在冰上放置1 h，隨后在4 ℃條件下10 000 g離心10 min ,2次沉淀噬菌體，最后用5 mL PBS溶液重懸沉淀.

將含10 mg·L-1平頦海蛇毒粗毒的0.1mol pH 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液加至細胞培養瓶，4 ℃過夜包被.經10 mmol pH 7.4 PBS清洗3次后，加入含10%脫脂奶粉的10 mmol pH 7.4 PBS，于37 ℃封閉1 h.經PBS清洗后，加入20 mL噬菌體展示單鏈抗體文庫，37 ℃孵育2 h.隨后，用PBST洗滌15次，再用PBS洗滌10次以去除非特異性結合的噬菌體.加入10 mL處于對數期的TG1菌液，37 ℃搖床培養1 h.將產物轉入離心管中，加入M13K07輔助噬菌體、氨芐和2%葡萄糖，37 ℃搖床繼續培養1 h.4 000 r·min-1離心10 min，重懸沉淀于2×YT-AK，37 ℃過夜.之后的各輪富集時均加入10 mL噬菌體展示單鏈抗體文庫.

1.7 單鏈抗體噬菌體ELISA檢測

經過5輪吸附—洗脫—富集篩選后，對篩選所得的單鏈抗體噬菌體進行ELISA檢測.用質量濃度為10 mg·L-1的平頦海蛇毒包被96孔板，每孔100 μL，4 ℃過夜.PBST清洗3次后，用含2%脫脂奶粉的PBST溶液于37 ℃封閉1 h.經PBST清洗3次后，加入篩選所得產物，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.再用PBST清洗3次，隨后加入鼠抗M13抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.用PBST清洗后，加入HRP標記的兔抗鼠抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.最后用PBST清洗5次，加入TMB底物液，反應20 min后用2.5 mol·L-1硫酸終止反應.用SpectroMax 384酶標儀讀取450 nm下的吸光值.

2 結果與分析

2.1 單鏈抗體基因的構建

用 1%瓊脂糖電泳檢測小鼠IgG輕鏈可變區、重鏈可變區和單鏈抗體片段的擴增產物顯示，輕鏈和重鏈可變區片段分子質量分別約為320和360 bp(圖1)，單鏈抗體片段約為750 bp(圖2)，與NCBI數據庫公開的鼠源IgG輕鏈、重鏈和單鏈抗體片段長度相符.3種片段的PCR產物經測序后與NCBI數據庫公開數據比對結果顯示，輕鏈和重鏈可變區片段分別與小家鼠IgG輕鏈、重鏈可變區片段高度相似，相似度均大于95%(圖3)，表明目的片段擴增并連接成功.

*為相同堿基.圖3 ScFv片段序列相似性比對結果注：H2為ScFv片段中的重鏈可變區片段；L2為ScFv片段中的輕鏈可變區片段；K2為小家鼠IgG重鏈可變區片段-NCBI登錄號KF208249；A2為小家鼠IgG輕鏈可變區片段-NCBI登錄號AY374128.

2.2 單鏈抗體基因重組噬菌體轉化

將攜帶有單鏈抗體基因的重組噬菌體轉化至大腸桿菌TG1感受態細胞，倒SOBAG平板，經30 ℃過夜培養后，有明顯克隆長出；對照組為未經轉化的TG1菌，在30 ℃過夜培養后，無克隆長出，結果表明重組噬菌體轉化成功(圖4).

圖4 重組噬菌體轉化TG1效果注：左圖為重組噬菌體陽性克隆組；右圖為對照組.

2.3 單鏈抗體噬菌體陽性克隆篩選

經過5輪吸附——洗脫——富集篩選后，以平頦海蛇毒蛋白為包被抗原，用篩選所得的單鏈抗體噬菌體進行ELISA檢測免疫效價.結果顯示，2個陽性組(P1和P2)的OD平均值分別為0.15和0.17，對照組(C)的OD平均值為0.10(圖5).陽性組的信號強度微弱.

圖5 陽性和陰性克隆OD值的比較注：C為陰性克??；P1、P2為陽性克隆.

3 討論

與傳統抗體制備技術相比，基因工程抗體制備技術能有效改造并獲得抗體功能作用片段，經過精簡后的抗體分子將發揮更為專一的作用，并提高單位劑量抗體制劑的效價[10]2.同時，由于去除了非功能結構，也將有效降低抗體過敏反應[11-13].抗蛇毒血清是當前治療毒蛇咬傷的最佳藥物，全球每年的蛇傷危害較為嚴重.由于傳統方法制備抗蛇毒血清周期長、成本高、保存期短以及相較于其他藥物的需求較小等一系列問題，導致生產企業的生產積極性不高，常常出現供需失衡[14-16].平頦海蛇為眼鏡蛇科海蛇屬毒蛇，其毒液是多種酶和多肽的混合物，毒性強烈，是我國海域中常見的有毒爬行動物，對海上作業及近海旅游等造成了一定的危害.國內至今仍缺少治療該種毒蛇咬傷的抗體類藥物，利用基因工程技術改造并制備平頦海蛇毒單鏈抗體有望為制備新型小分子抗海蛇毒藥物提供參考.

1990年,Mccafferty等[17]最早通過 PCR 擴增機體抗體可變區基因并重組表達于噬菌體表面，構建噬菌體抗體庫.利用噬菌體展示技術制備單鏈抗體，已成為當前抗體研制的熱點之一[10]1.該技術是一種高效基因表達篩選技術，將外源蛋白或多肽與特定的噬菌體衣殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持相對獨立的空間構象和生物活性，有利于靶分子的特異性識別及結合，從而實現基因型和表現型的統一.有別于傳統的單克隆抗體技術，噬菌體展示技術可對各種抗原進行高通量篩選，快速獲得抗體片段，從而迅速得到廣泛應用.將單鏈抗體連接pCANTAB-5E載體并轉化至大腸桿菌TG1感受態細胞擴增，建立單鏈抗體庫.抗體庫的庫容量和多樣性是決定抗體庫質量的兩個重要的指標.庫容量越大，從中獲得高親和力抗體的可能性就越大；多樣性好，從中篩選到不同目的抗體的概率就大.

本研究用平頦海蛇毒腹腔注射小鼠進行周期性免疫，以誘導小鼠免疫系統對海蛇毒產生應答，獲取可編碼識別該種蛇毒組分的小鼠免疫球蛋白mRNA.制備單鏈抗體基因時，使用RT-PCR技術結合SOE-PCR技術，以cDNA為模板擴增抗體重鏈和輕鏈可變區片段并以linker相連，此方法可以免去限制性內切酶消化，連接酶的處理等環節，只需在設計引物時引入重疊區域就可以實現目的片段之間的有效拼接[18-19].利用特定引物擴增的輕鏈和重鏈可變區片段及單鏈抗體基因經瓊脂糖凝膠電泳驗證無非特異性條帶出現，經純化后去除引物二聚體便可得到較為純凈的目的基因，測序結果也進一步證明了所得基因片段的準確性，可用于后續表達載體的構建.

盡管本研究已構建了相應的單鏈抗體庫，但在用ELISA檢測由平頦海蛇毒篩選過的噬菌體文庫時，并未達到理想效果.五輪篩選的陽性克隆吸光值較低，無法呈現強陽性檢測效果，可能在篩選過程中，存在較多的非特異性的融合噬菌體，還可能是由于噬菌體濃度過低.因此，在對單鏈抗體噬菌體文庫篩選過程仍然需要進一步改善和優化.應在篩選過程中，通過進一步構建次級庫，改進洗脫條件，增加篩選模式等措施以使陽性重組噬菌體得到有效富集.本研究嘗試了利用基因工程技術構建平頦海蛇毒單鏈抗體并建立了單鏈抗體噬菌體展示文庫，初步嘗試篩選單鏈抗體，總結了一套切實可行的實驗方案，后期應進一步提高陽性富集效果.