一株海洋發光細菌的分離、鑒定及發光特性

于振豪,呂嵐清,劉文侃,黃 馨,李玉潔,卓文琪,陳 燕,馬 軍,黃 海

(1.海南熱帶海洋學院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室;b.海南省熱帶海洋漁業資源保護與利用重點實驗室;c.水產與生命學院，海南 三亞 572022;2.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315823)

0 引言

發光細菌是一類在正常生理條件下能產生熒光素酶并利用其發射可見熒光的細菌.目前，已知的發光細菌主要涉及弧菌屬(Vibrio)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、發光桿菌屬(Photobacterium)和光桿菌屬(Photorhabdus)[1]，其中，明亮發光桿菌(P.Phosphoreum)、費氏弧菌(V.fischeri)和青?；【?V.qinghaiensis)等被廣泛應用于環境毒性檢測[2-4].這些發光細菌都是在氧氣的作用下，由細菌熒光素酶催化長鏈脂肪醛(RCHO)和還原型黃素單核苷酸(FMNH2)的氧化還原反應，釋放出波長450～490 nm的可見熒光.發光細菌的發光特性一直是人們比較關注的問題，各國研究人員對此進行了不少研究，如發光細菌的發光機制，發光基因Lux系統及其表達產物熒光素酶等[5-8].研究表明，任何干擾或損害細菌正常生理代謝過程的因素均會對發光細菌的發光強度產生不同程度的影響[9-10].因此，利用發光細菌作為指示生物監測環境中有毒有害物質的污染風險，已成為發光細菌的主要用途之一.發光細菌與環境急性毒性物質的關系，以及利用海洋發光細菌作為生物傳感器的研究也是目前的熱點之一[11-12].發光細菌發光所依賴的熒光素酶是一種與細胞膜結合的糖蛋白，其與細菌呼吸代謝密切相關[13].通過改變細胞膜的滲透性、阻礙細胞膜的電子傳遞、抑制蛋白質的合成等方式均能影響細胞呼吸鏈的正常運行，從而影響發光細菌的熒光強度.研究表明，不同鹽濃度、pH值和溫度對不同發光細菌的生長及發光產生不同程度的影響[14]，而不同發光細菌對環境中不同類型重金屬的敏感程度存在顯著性差異[15].因此，深入探究發光細菌的發光特性是進一步應用發光細菌的前提和基礎.本研究通過對一株海水中分離得到的發光細菌進行發光特性的探索，旨在發現該菌株的應用前景，為進一步拓展其應用領域提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試劑

高鹽培養基(固體)：酵母膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉30 g，磷酸氫二鈉5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，甘油0.6 g，瓊脂粉15 g，去離子水1 000 mL，pH(7.5±0.2)，高溫高壓滅菌后備用.

液體培養基：酵母膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉30 g，磷酸氫二鈉5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，甘油0.6 g，去離子水1 000 mL，pH(7.5±0.2)，高溫高壓滅菌后備用.

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀0.27 g，去離子水1 000 mL，高溫高壓滅菌后備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

從三亞灣近岸(E/W:109°493 472′；N/S:18°259 866′)采集海水500 mL(pH8.2，鹽度33)，將取樣的海水靜置30 min后取上清液，按一定濃度梯度稀釋后涂布于高鹽培養基上，30 ℃恒溫培養18～24 h，在暗環境中觀察平板上菌落的發光情況，并標記，挑取一枚發光良好的菌落，命名為L2.

1.2.2 菌株鑒定

細菌生理生化實驗參考《常見細菌系統鑒定手冊》[16]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17].菌株16S rRNA基因保守序列使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增.PCR反應體系(50 μL)中,含有2 μL DNA模板，引物各0.5 μL，4 μL dNTPs混合液，10×PCR緩沖液5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.25 μL.擴增前95 ℃預變性3 min，擴增循環為95 ℃變性30 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環.擴增產物經PCR產物純化試劑盒(Axygen PCR清潔試劑盒)純化后，送北京六合華大基因科技有限公司測序.

測得的菌株16S rRNA基因序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析.采用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining算法構建系統發育樹，進化距離使用Kimura 2-parameter模型進行計算，系統發育樹使用1 000次重復的Bootstraps進行統計學檢驗.

1.2.3 發光強度與細菌菌量的關系

將菌株接種于固體培養基上，挑取單個菌落接種于5 mL液體培養基中，在30 ℃下150 r·min-1搖床振蕩培養24 h.以0.1%的接種量將種子液接種在液體培養基中，在30 ℃下150 r·min-1搖床振蕩培養6 h，吸取1 mL菌液作為原液，使用PBS按照5倍稀釋梯度獲得不同濃度的菌液，各取200 μL加入96孔板上，每個濃度至少3個孔，用化學發光儀(Analytik Jena,ChemStudio SA2)對其進行曝光10 min處理，之后用分析軟件VisionWorks(v8.20)對結果進行分析，讀出熒光強度值；另外取不同濃度的菌液200 μL，涂布于營養瓊脂平板，30 ℃恒溫培養12 h后，讀取平板上的菌落數量，根據稀釋倍數計算出原液及不同稀釋倍數下單位體積的細菌菌落形成單位(cfu·mL-1)，以Lg(cfu·mL-1)為橫坐標，不同濃度菌液的熒光強度為縱坐標，繪制發光強度與細菌菌量的關系圖，同時進行線性回歸分析.

1.2.4 菌株生長曲線及發光強度變化曲線的繪制

以0.1%接種量將細菌L2轉接至24個含有100 mL培養基的三角瓶中，在30 ℃下恒溫培養24 h.從0 h開始，每隔1 h取1 mL菌液，10 h以后，每隔2 h取1 mL菌液.不同時間點所取的菌液分為2份，1份按10倍梯度稀釋涂平板，培養24 h后，讀取單菌落數量，并計算cfu·mL-1；取另一份菌液200 μL讀取發光強度.以時間為橫坐標，Lg(cfu·mL-1)或熒光強度為縱坐標，繪制生長曲線和發光強度曲線.

1.2.5 不同培養溫度、pH值和氯化鈉濃度對發光強度的影響

以0.1%接種量將細菌L2轉接至不同培養條件下的培養基中，培養溫度設置為15，20，25，30，35，40 ℃；初始pH值設置為4，5，6，7，8，9，10，11，12；氯化鈉濃度設置為0，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%.不同單因素條件培養24 h，取200 μL讀取發光強度.以時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標繪制發光強度的曲線.

1.2.6 數據處理及分析

采用SPSS(v20)軟件對實驗數據進行統計分析.所有實驗數據均重復3次，并計算標準誤差，結果以“平均值±標準差(Mean ± SD)”表示.

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

從圖1(a)和圖1(c)可知，L2單菌落為圓形，邊緣較光滑，中心稍微隆起，略呈乳白色，能在暗處發出藍綠色熒光.L2菌體呈短桿狀，革蘭氏染色為紫紅色，確定是革蘭氏陰性菌圖1(b).從表1可知，L2細菌不能在4 ℃或40 ℃生長，不產淀粉酶和明膠酶等，可以利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，接觸酶反應為陰性，V.P試驗和吲哚試驗均顯陽性，這些特征與發光桿菌屬的鰒魚發光桿菌(P.leiognathi)較為相似.

圖1 L2菌株的菌落形態、革蘭氏染色及其熒光圖

表1 不同菌株的生化特征分析

2.2 16S rRNA 序列分析

16S rRNA序列比對結果進一步確定L2菌株與P.leiognathi(X74686)最為接近，相似度為96.8%，詳細結果見圖2.

圖2 基于16S rRNA序列構建的系統發育樹

2.3 發光強度與細菌菌量的關系

本研究用熒光/化學發光檢測儀檢測發光細菌的熒光強度，需要確定熒光強度的檢測范圍及其與細菌菌量的關系.從圖3可知，不同濃度的細菌所產生的熒光強度與菌量Lg(cfu·mL-1)成較為明顯的線性關系(R2=0.962 2)，熒光強度檢測的有效范圍在(371.50±28.81)～(24 639.31±181.91).

圖3 不同細菌濃度的熒光強度及線性回歸分析

2.4 菌株生長曲線及發光強度變化曲線

如圖4所示，在5 h左右時，菌體已經進入生長期，此時細菌才開始發光，發光強度相對較弱，細菌發光與生長周期不同步，相對滯后，屬于非耦聯關系.培養5～9 h過程中，菌量逐漸升高并趨于穩定，進入穩定期，而此時細菌發光強度快速增長，在9 h時達到最大值，但維持時間較短.此后，發光強度則呈現出明顯的下降趨勢，在15 h以后，發光強度下降趨勢逐步減緩，而此時細菌也進入衰亡期，這可能是由于細菌快速增長消耗大量氧氣，而氧氣是細菌生長及發光過程中的必備條件之一.

圖4 菌株L2的生長曲線及發光曲線

2.5 發光影響因素分析

2.5.1 不同培養溫度對發光強度的影響

從圖5可看出，細菌L2在15～40 ℃之間均可以生長，但其發光的溫度范圍為20～35 ℃，其中30 ℃為最佳發光條件，培養溫度低于或超過30 ℃時，細菌生長均出現一定程度的下降，細菌發光強度也明顯受到抑制，尤其是溫度低于20 ℃時，熒光強度降低了約73%，這說明該菌對溫度較為敏感.

(a)熒光強度變化情況 (b)細菌生長變化情況圖5 不同培養溫度下L2菌株發光強度及細菌生長變化情況

2.4.3 不同氯化鈉濃度對發光強度的影響

從圖6(a)和圖6(b)可知，細菌L2在鹽濃度為0～8%之間均可以生長，屬于廣鹽性細菌.當氯化鈉濃度為1%～4%時，細菌L2生長最為旺盛，在此范圍內，熒光強度隨氯化鈉濃度上升而增強，氯化鈉濃度為4%時，熒光強度達到最大值，此后，熒光強度隨氯化鈉濃度上升而快速下降.當培養基中沒有氯化鈉時，細菌L2完全丟失發光特性，這說明該菌的發光特性需要氯化鈉等鹽離子的參與；當培養基中氯化鈉濃度達到8%時，該菌的發光特性受到強烈抑制，這有可能是過高的鹽離子濃度破壞了菌體滲透壓平衡，致使發光特性下降或丟失.

(a)熒光強度變化情況 (b)細菌生長變化情況圖6 不同氯化鈉濃度下L2菌株發光強度及細菌生長變化情況

2.4.4 不同初始pH對發光強度的影響

從圖7(a)和圖7(b)可知，細菌L2可以在pH為4～10的初始條件下生長，其中在pH為5～10的范圍內，該菌都有不同程度的發光，初始pH為8時發光最優.同時,細菌L2在弱堿環境中比在弱酸環境中發光更強，而強堿(pH≥10)和強酸(pH≤4)都會嚴重影響細菌L2的發光特性，這可能是偏酸或偏堿環境會嚴重影響細菌的生長.

(a)熒光強度變化情況 (b)細菌生長變化情況圖7 不同初始pH下L2菌株發光強度及細菌生長變化情況

3 討論

發光細菌的發光本質是由于細菌含有熒光素酶，該酶被氧化催化后發生復雜的化學反應從而發出一種波長約為450～490 nm的可見熒光.從20世紀開始，關于細菌發光強度的判定主要是以肉眼觀察到的結果為依據，因此,具有較強的主觀性，會影響實驗結果的準確性.后來，出現了專業的測光儀，對發光強度的測定有了更可靠的依據.吳偉等[21]就采用DXY-1型生物發光光度計進行測定，劉彩琴等人[22]的研究中使用了F96熒光分光光度計，從而可計算發光細菌的相對發光強度，使結果更準確.本研究采用更為先進的熒光/化學發光分析儀檢測細菌的發光強度，并利用專業分析軟件對熒光強度進行定量分析，該方法操作簡便、快捷、準確，這為今后細菌發光強度的定量分析及檢測開辟了新的途徑.

海洋發光細菌對環境pH的變化較為敏感，其生長和發光的pH范圍通常在6～8.5之間.本研究中分離到的菌株L2，可以在pH4～10的環境中生長，其中,發光范圍在5～10之間，在應用的環境中對酸堿的耐受范圍更廣.相對于弱酸環境(pH5)來說，該菌在強堿環境(pH10)中有更好的發光特性，這可能與其自然狀態下的生境有關.海水的pH一般在7.5～8.3之間，說明該菌的發光特性與自然條件基本符合.

杜宗軍等[23]從青島海洋沉積物中分離得到的一株海洋發光細菌，該菌能在氯化鈉濃度為0.5%～5%的條件下生長和發光.許鴻章等[24]發現,有的海洋細菌可以在氯化鈉濃度高達7.5%的培養基中生長，但是其最適生長和發光的氯化鈉濃度為3%.本研究中分離到的菌株L2，在氯化鈉濃度為0～8%的培養基中均能生長，其中發光范圍在1%～7%之間，在氯化鈉濃度為4%時，發光強度值達到最大，這說明該菌株具有范圍更廣的耐鹽性，可應用于一些高鹽度環境中的毒性監測，如監測鹽堿地中的環境毒性以及海水養殖中的生物毒性等.