馬尾藻多糖提取工藝的優化及抗氧化性

齊 丹，賴文婷，肖玉秀

(海南熱帶海洋學院 a.生態環境學院;b.理學院，海南 三亞 572022)

0 引言

馬尾藻(Sargassum)在我國多產于東南沿海的溫水海域，資源豐富，營養價值高，食用歷史悠久[1].研究表明，海藻中提取的海藻多糖及其衍生物具有免疫調節、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種生物和生理活性[2-6].多糖溶于水，不溶于乙醇.水提醇沉法便是根據多糖在水和乙醇中溶解度不同的特性，將其分離提取的一種方法.與其他提取方法相比，該方法成本低、生產方便、簡單安全、可用于大規模生產.本研究利用正交實驗優化馬尾藻多糖的提取工藝，并研究其抗氧化性，旨在為馬尾藻的進一步開發提供依據.

1 材料與方法

1.1 樣品預處理

采集海南省三亞市潮間帶新鮮的大洲馬尾藻(S.dazhouense)，洗凈泥沙和表面鹽離子，80 ℃干燥，粉碎過50目標準篩，保存于干燥器內待用.

1.2 多糖提取

參考于淑池等提取海南苦丁茶多糖的方法[7]，提取馬尾藻多糖.稱取一定量的干燥馬尾藻粉加入純水，一定溫度下恒溫水浴一段時間，不斷攪拌，靜置冷卻后離心，取上清液.多次提取，合并上清液.將多次提取后的上清液使用旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮后溶液冷卻至常溫，活性炭脫色后緩慢加入乙醇，不斷攪拌，析出多糖沉淀，再次離心，收集多糖.最后將多糖依次用無水甲醇、丙酮和乙醚洗滌，除去水分和雜質，將洗滌后的多糖溶解于100 mL去離子水中，得到多糖溶液.

1.3多糖提取率測定

采用苯酚-硫酸法[8-9]測定馬尾藻多糖濃度，計算提取率.

1.4正交實驗

根據單因素實驗結果確定實驗因素和水平，采用正交表設計實驗，利用正交設計助手和SPSSAU軟件對數據進行分析，優化馬尾藻多糖提取工藝.

1.5馬尾藻多糖體外抗氧化性測定

1.5.1 馬尾藻多糖的DPPH抗氧化活性

采用DPPH法[10]測定馬尾藻多糖DPPH抗氧化活性.配制DPPH無水乙醇溶液，取不同濃度的馬尾藻多糖溶液與DPPH無水乙醇溶液混勻，控溫避光反應30 min，517 nm處測吸光值.

1.5.2馬尾藻多糖對羥基自由基的清除作用

采用Fenton法[11]測定馬尾藻多糖對羥基自由基的清除作用.在9 mmol·L-1FeSO4溶液中加入不同濃度的馬尾藻多糖溶液，混勻后加入H2O2溶液，靜置10 min，再加入9 mmol·L-1水楊酸溶液，搖勻靜置1 h后，測510 nm處吸光值.

1.5.3 馬尾藻多糖的還原力測定

采用三氯乙酸法[12]測定馬尾藻多糖的還原力.分別取不同濃度的馬尾藻多糖溶液，加入pH6.6磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃下水浴加熱20 min，冷卻至室溫，再分別加入三氯乙酸和FeCl3溶液，10 min后測定其在700 nm處的吸光度.

1.6數據處理

使用OriginPro 9.1進行數據處理并制圖.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同提取時間對馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g預處理后的馬尾藻粉，采用1∶40的固液比加入400 mL的蒸餾水中，于80 ℃條件下，分別水浴提取2，3，4，5，6 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測定多糖提取率，結果見圖1.

圖1 不同提取時間對多糖提取率的影響

從圖1可知，提取時間為2～4 h時，多糖提取率隨提取時間的增加而大幅度提高，從7.78 g·kg-1迅速升高至14.71 g·kg-1；提取時間為4～6 h時，多糖的提取率變化不大，維持在14.7～14.9 g·kg-1之間；當提取時間為5 h時，多糖提取率最大，且為14.84 g·kg-1.

因此，馬尾藻多糖最佳提取時間約為4 h，此時多糖幾乎完全溶于水溶液中，再增加水浴時間，對馬尾藻多糖的提取率無明顯提高，而且增加能耗.

2.1.2不同水浴溫度對馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經預處理后的馬尾藻粉，按1∶40的固液比加入蒸餾水，分別在60，70，80，90，100 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測定多糖提取率.

圖2 不同提取溫度對多糖提取率的影響

從圖2可知，提取溫度為60～70 ℃時，馬尾藻多糖提取率增長速度較慢，約為12.5 g·kg-1；提取溫度為70～90 ℃時，馬尾藻多糖提取率顯著增加，從12.64 g·kg-1增加至15.65 g·kg-1；提取溫度為90～100 ℃時，馬尾藻多糖提取率不再升高反而輕微降低.實驗結果表明，當提取溫度為90 ℃時，多糖提取率最大(15.65 g·kg-1),因此，最佳提取溫度為90 ℃.

2.1.3 不同固液比對馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經預處理后的馬尾藻粉，分別按1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的固液比加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉速下離心30 min.提取2次，合并上清液，然后測定多糖提取率，結果見圖3.

圖3 不同固液比對多糖提取率的影響

從圖3可知，固液比在1∶20～1∶30時，馬尾藻多糖提取率增加緩慢，由10.44 g·kg-1增加到11.08 g·kg-1；固液比在1∶30～1∶50時，馬尾藻多糖提取率迅速增加，從11.08 g·kg-1增加至15.20 g·kg-1；固液比在1∶50～1∶60時，馬尾藻多糖提取率基本不變，由15.20 g·kg-1增加到15.31 g·kg-1.因此，最佳的提取固液比為1∶50.

2.1.4 不同提取次數對馬尾藻多糖提取率的影響

分別稱取5份10 g經預處理后的馬尾藻粉，按1∶40固液比加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取4 h，將冷卻后的溶液在2 500 r·min-1的轉速下離心30 min，分別提取1，2，3次，合并上清液，然后測定多糖提取率，結果見圖4.

圖4 不同提取次數對多糖提取率的影響

從圖4可知，馬尾藻多糖在提取1次時，提取率為10.61 g·kg-1，并不能完全提取馬尾藻多糖；提取次數為2時，馬尾藻多糖的提取率達13.45 g·kg-1；提取次數3次時，馬尾藻多糖的提取率為13.54 g·kg-1，只比提取2次的結果高0.09 g·kg-1.從節約提取時間、成本和能耗角度考慮，提取次數為2次時最佳.

2.2正交試驗優化馬尾藻多糖提取條件

以多糖提取率為指標，以提取時間、提取溫度、固液比、提取次數為因素，根據單因素最優點確定各因素的水平值(表1).選用L9(34)正交表設計實驗，用正交設計助手軟件對數據進行分析，研究馬尾藻多糖提取工藝優化(實驗設計及結果見表2)，以確定最優工藝.

表1 正交因素水平表

表2 L9(34)正交實驗方案設計及結果

表2(續)

從表2可知，提取馬尾藻多糖的主次影響因素為：提取溫度>提取時間>固液比>次數.根據極差分析可以得出最佳提取工藝條件組合為A3B2C3D3，即提取時間5 h，溫度90 ℃，固液比1∶60，提取次數3.

通過正交設計軟件和SPSSAU v20.0軟件對實驗數據進行計算分析，采用對提取率影響較大的時間、溫度、固液比進行多因素方差分析，結果見表3和表4.

表3 正交實驗結果方差分析表

表4 三因素方差分析結果

從表4可知：提取時間和提取溫度呈現出顯著性(P<0.05)，說明主效應存在，會對提取率產生差異關系；固液比沒有呈現出顯著性(P>0.05) ，說明固液比并不會對提取率產生差異關系.

為了評價最佳工藝穩定性，稱取馬尾藻樣品10 g進行重復實驗.多糖提取率分別為18.59%，18.43%和18.65%，平均值為18.56%，可見A3B2C3D3提取率較為穩定.

2.3體外抗氧化性

2.3.1 DPPH法抗氧化活性

DPPH(1,1-二苯基-2-吡啶酰肼)是一種穩定的有機物自由基，能接受氫自由基或電子，成為一種穩定的抗磁分子，在517 nm處有一強吸收峰，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，被廣泛應用于自由基的測定[13].

圖5 馬尾藻多糖對DPPH自由基清除能力

從圖5可看出，馬尾藻多糖具有一定的DPPH自由基清除活性，隨著多糖濃度升高，清除率逐漸增強.當多糖濃度為2 g·L-1時，對DPPH自由基清除率可達22.988%.

2.3.2 羥基自由基的清除作用

Fenton反應是二價鐵與過氧化氫反應生成羥基自由基進行的后續一系列反應的統稱[14].Fenton反應生成羥基自由基，而多糖可以抑制反應的進行并清除已產生的羥基自由基，其清除能力可通過520 nm處的吸光度反應[15].

從圖6可看出，馬尾藻多糖對羥基自由基具有一定的清除能力，隨著多糖濃度升高，清除率增強.當多糖濃度為0.1～1.0 g·L-1時，對羥基自由基清除率迅速增加;當多糖濃度為1.0～2.0 g·L-1時，對羥基自由基清除率增長減緩;當多糖濃度均為2 g·L-1時，羥基自由基清除率可達27.596%.

圖6 馬尾藻多糖對羥基自由基清除能力

2.3.3 馬尾藻多糖的還原力

還原力是評價抗氧化性的指標之一.具有還原能力的物質作為電子供體，能夠還原脂質過氧化過程中的中間氧化產物，因此物質的還原能力可以看作其潛在的抗氧化性能的重要體現[16].還原力測定的方法是利用樣品的抗氧化能力，可以把赤血鹽[K3Fe(CN)6]還原成黃血鹽[K4Fe(CN)6]，再將黃血鹽與含鐵離子的溶液混合反應，測定生成的普魯士藍在700 nm波長吸光值，以此來檢驗其生成量的多少.而吸光值的大小是判斷樣品還原能力的依據，樣品還原力越強，吸光值越高.

圖7 馬尾藻多糖的還原力

從圖7可看出，馬尾藻多糖雖具有一定的還原能力，且隨著多糖濃度升高，還原力越強.當多糖濃度為2 g·L-1時，吸光度值可達0.497，但明顯不及維生素C的還原性強.當維生素C濃度為2 g·L-1時，吸光度值可達1.324，此時馬尾藻多糖的還原力約為維生素C的1/3.

3 結論

多糖作為馬尾藻中重要的活性成分之一，具有廣闊的應用發展前景.本研究首先采用正交實驗方法，確定馬尾藻多糖的最佳提取工藝條件為提取時間5 h，溫度90 ℃，固液比1∶60，提取次數3.然后，通過DPPH法、Fenton法和三氯乙酸法，分別測定馬尾藻多糖對DPPH自由基、羥基自由基的清除能力和還原力.實驗結果表明，馬尾藻多糖具有明顯的抗氧化性.