細胞焦亡的分子機制及研究進展

林文 曹珈琪 張燕

[摘要]細胞焦亡是一種由炎癥小體驅動的程序性非典型細胞死亡模式，由Caspase-1/-11/-4/5介導。Gasdermin家族蛋白是近年發現的致孔效應蛋白家族，該家族蛋白通常處于自抑制狀態，被稱為是細胞焦亡的“劊子手”，其中最為重要的焦亡執行蛋白是Gasdermin D和Gasdermin E。發生細胞焦亡時，激活的Caspases將GSDMD/GSDME切割為N端孔洞形成片段和C端抑制片段，造成膜穿孔，釋放炎癥因子等細胞內容物引發細胞焦亡。隨著細胞焦亡的深入研究，發現其在多種疾病尤其是腫瘤發生發展中扮演著重要的角色。本文總結了細胞焦亡的分子機制及其在癌癥中的研究進展。

[關鍵詞]細胞焦亡;細胞程序性死亡;炎癥小體;腫瘤;GSDMD

[中圖分類號] R737.25 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2020）9（c）-0025-05

[Abstract] Pyroptosis is a pattern of atypical cell death driven by inflammasome， mediated by Caspase-1/-11/-4/5. Gasdermin family proteins are identified as pore-forming proteins acting as the "executor" of pyroptosis， which usually remain in self-suppressed state. Gasdermin D and Gasdermin E are the most key palyers in pyroptosis. In the pathway of pyroptosis， GSDMD/GSDME is cleaved into N-terminal pore-forming fragments and C-terminal inhibitory fragments by activated Caspases， membrane perforation is initiated in turn， and cell contents such as inflammatory factors are released to trigger pyroptosis. Emerging evidences support that pyroptosis plays an important role in the development of various diseases， especially in tumors. This article summarizes the underlying molecular mechanism of pyroptosis and reviews the research progress in cancer.

[Key words] Pyroptosis; Programmed cell death; Inflammasome; Tumor; GSDMD

在生物個體的生長和發育期間，細胞死亡隨時都會發生，這是生物界普遍存在的生命現象，在多細胞生物的生長、發育和體內平衡中起著重要作用。細胞死亡的方式主要分為兩類，非程序性死亡和程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]，PCD又可分為非炎癥反應介導的自噬（autophagy）和凋亡（apoptosis）及炎癥反應介導的細胞焦亡[2]。近年來，細胞焦亡成為PCD領域的研究熱點，隨著調控焦亡的信號通路逐漸闡明，研究人員也發現細胞焦亡在人類多種疾病中所產生的巨大影響。

1細胞焦亡的研究歷史

細胞焦亡伴隨著炎癥反應的細胞死亡方式早在20世紀90年代就已被關注，1992年Zychlinsky等[3]首次發現，用侵襲性志賀菌和鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞可誘導宿主細胞死亡，主要觀察到宿主細胞DNA片段化和膜起泡，最初認為是凋亡所致，但由于Caspase-3被裂解是晚期事件，并且死亡過程需要Caspase-1的參與，從而引起廣泛的關注，隨后在1994～2000年，進一步的分析表明，巨噬細胞的死亡獨特地依賴于Caspase-1而不是凋亡相關Caspase，并且伴隨著細胞膜的破壞和炎癥細胞因子和其他小分子的釋放[4-5]。2001年Cookson及其同事將這種依賴于炎性體的細胞死亡稱為“pyroptosis”，源于希臘語中與火或熱有關的“pyro”[6]，至此細胞焦亡被明確定義。此后，雖然有大量關于焦亡的報道，但直到2015年Gasdermin D（GSDMD）被發現為Caspase-1和Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的切割靶點時，細胞焦亡的關鍵因子才被發現，GSDMD被稱為焦亡的“劊子手”[7]。隨著研究的深入，Gasdermin超家族中其他蛋白，如Gasdermin E（GSDME），被Caspase-3激活，也會誘發細胞焦亡[8]。在2018年，細胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）定義細胞焦亡是由Gasdermin蛋白家族成員形成質膜穿孔的炎癥細胞PCD[9]。如今細胞焦亡這種程序性細胞死亡方式已經逐漸被人們所了解，越來越多的研究發現細胞焦亡在人類癌癥、自身免疫性疾病、神經系統相關疾病中均發揮著重要的作用。

2細胞焦亡分子機制

2.1模式識別受體與炎癥小體

免疫系統以天然免疫和適應性免疫兩種免疫方式保護著人體，二者均依賴特異性受體對“非我”分子模式進行識別，隨后利用不同的機制消除攜帶模式分子的病原體[10]。其中作為宿主防御的第一道防線的天然免疫通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體特有保守的關鍵模式分子，病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）以及內源性危險信號分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），立即引發機體反應，以遏制入侵的微生物，為激活隨后的適應性免疫反應奠定基礎[11]。胞漿中的PRRs包括Toll樣受體（TLRs）、細胞內核苷酸結合寡聚結構域（NOD）樣受體（NLRs）和AIM2樣受體（ALRs）[12]。

炎癥小體在細胞質中以多蛋白復合物狀態存在，由信號特異性傳感器蛋白，銜接子蛋白，以及效應蛋白構成[13]。信號特異性傳感器蛋白主要是富含中央核苷酸結合域（nucleotide binding domain，NBD）和亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）的NOD-like receptor，NLR蛋白家族（NLRP1、NLRC4、NLRP3、NAIP2/5）和HIN-200蛋白家族（hematopoietic IFN-inducible nuclear antigen with 200 amino acid repeats），如（AIM2），銜接子蛋白則是含有Caspase激活募集域（Caspase activation and recruitment domain，CARD）的凋亡相關微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC），Caspase為效應蛋白[14]。

2.2 Caspase-1介導的經典途徑細胞焦亡

Caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase）是一種含有半胱氨酸的內源性天冬氨酸蛋白水解酶，是生物體通過調節細胞死亡和炎癥來維持穩態的重要基因家族[15]。Caspase已被廣泛分類為凋亡性（哺乳動物中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8和Caspase-9）和炎癥性（人類Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12和小鼠Caspase-1、Caspase-11和Caspase-129）[16]。細胞焦亡則是由Caspase所介導發生的，其中經典途徑的細胞焦亡由Caspase-1介導，非經典細胞焦亡途徑由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導。

Caspase-1在通常狀態下作為一種惰性酶原存在，是炎癥小體的重要組成部分。當胞漿PRRs受到特定PAMPs和DAMPs的刺激下，PRR通過（或不通過）ASC和Pro-Caspase-1形成組裝成為炎癥小體，炎癥小體通過反平行二聚作用形成Caspase-1酶原激活平臺，該反向平行二聚作用使一個Caspase-1分子的催化結構域與需要切割以激活該酶的兩個位點之一接近，隨后Caspase-1會自剪切激活，從酶原變為具有活性的蛋白水解酶，這是細胞焦亡發生重要的一環[17]。激活后的Caspase-1不僅可以介導促炎癥細胞因子[白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-18（IL-18）]的成熟和分泌，還可以直接作用于GSDMD[18]。Caspase-1在其中央連接區將自抑制狀態下的GSDMD切割為具有穿孔活性的31KDa氨基末端（NT）和22KDa的羧基末端（CT），隨后，GSDMD-N通過膜脂相互作用方式，與細胞膜內表面的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰絲氨酸結合，并在脂質雙層中形成內徑10～20 nm寡聚孔，細胞膜上的穿孔可直接釋放被Caspase-1激活的分子直徑約為5 nm的IL-1β和IL-18以及其他小的胞漿蛋白，如小GTP酶、半乳糖凝集素或半胱氨酸型內肽酶抑制劑胱抑素等。除此之外，質膜上大量的孔洞在膜的內側和外側之間引起連通，形成了非選擇性的膜通道，使質膜兩側離子濃度失衡，大量的水進入細胞，細胞腫脹，內容物逸出，細胞最終死亡[7，19-20]。不僅如此，焦亡細胞所釋放的IL-1β、IL-18是內源性免疫因子，引起發熱和刺激免疫細胞活化，促進淋巴細胞增殖和分泌抗體。IL-1β和IL-18的失控釋放會導致廣泛的炎癥反應和免疫性疾病[21]。

2.3非經典途徑的細胞焦亡

非經典的焦亡途徑，通常是細胞質脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）直接激活Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導焦亡，Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以直接被細胞內革蘭陰性細菌LPS刺激，以激活和水解自身的蛋白酶活性[22]。活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11也可以作用于GSDMD并產生與Caspase-1相同的裂解作用，從而導致細胞膜穿孔。激活的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11在NLRP3和ASC存在下可以與Caspase-1相互作用，從而促進其激活[23-24]。同樣的，Caspase-1裂解IL-1β和IL-18的前體以形成活性IL-1β和IL-18，通過GSDMD-NT形成的膜通道釋放并引起焦亡。與經典途徑不同的是，在非經典的細胞焦亡中，僅IL-1β和IL-18前體的裂解取決于Caspase-1，GSDMD的切割則是由其他已激活的炎癥性Caspases完成的[25]。

3細胞焦亡與癌癥的發生

近年研究顯示，多種癌癥的發生及治療與細胞焦亡密切相關。Wang等[26]研究表明，細胞焦亡關鍵蛋白GSDMD可能通過抑制ERK、STAT3和PI3K通路，進而抑制CyclinA2/CDK2復合物，導致細胞周期S/G2期阻滯，抑制胃癌增殖。Gao等[27]研究表明，與癌旁組織相比，非小細胞肺癌中的GSDMD蛋白表達水平顯著上調，經臨床數據分析，較高水平的GSDMD表達與患者腫瘤體積成正相關，并且影響著患者晚期的腫瘤淋巴結轉移。敲低GSDMD表達后抑制了小鼠腫瘤的生長。

GSDMD/GSDME是細胞焦亡發生的關鍵蛋白，因此大量研究靶點在于小分子或藥物觸發GSDMD介導的焦亡作用而抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力等。Wang等[28]發現二甲雙胍（Metformin）可誘發GSDMD介導的焦亡。Pizato等[29]發現Omega-3 二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可以在MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞中引發焦亡，與未經處理的細胞相比，經DHA處理的乳腺癌細胞發生了細胞焦亡，Caspase-1、GSDMD被激活，IL-1β分泌增加。Deng等[30]最近的一項研究發現，BIX-01294，一種二氮雜-喹唑啉-胺衍生物可誘導自噬通量，并且當BIX聯合順鉑（Cis-platinum，Cis）處理胃癌細胞，可以誘導GSDME介導的胃癌細胞發生焦亡。Chen等[31]的一項研究發現，與結直腸癌一樣，洛鉑會通過Caspase-3/GSDME信號傳導途徑在鼻咽癌細胞中誘導焦亡。海洋耐寒細菌假海變單胞菌TAC125產生的4-羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4-HBA），可誘導A549肺上皮癌細胞焦亡。研究發現4-HBA處理A549細胞后，可以激活Caspase-1，促使IL-18和IL-1表達增加，誘導肺腺癌細胞焦亡，進而促進細胞死亡[32]。花青素是屬于類黃酮家族的天然著色劑，其抗癌特性引起了科學界的廣泛關注[33]。Yue等[34]注意到花青素降低了口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細胞的活性，抑制了細胞的遷移和侵襲能力。花青素處理OSCC時，NLRP3、Caspase-1和IL-1的表達增強，激活細胞焦亡，同時，在Caspase-1抑制劑的作用下，花青素激活的細胞焦亡被抑制，而細胞活力、遷移和侵襲率隨之提高。化療耐藥是卵巢癌患者最常見的死亡原因之一，確定新型抗腫瘤藥物是當務之急。Qiao等[35]研究發現新型分子α-NETA[2-（anaphthoyl）ethyltrimethylammonium iodide]通過GSDMD/Caspase-4途徑誘導上皮性卵巢癌（EOC）細胞焦亡。此外，Caspase-4或GSDMD的敲低都會影響細胞α-NETA細胞的抑制活性，表明α-NETA通過焦亡途徑發揮作用。最近的另一研究發現[36]，大氣壓冷等離子體（cold atmospheric plasma，CAP）已被提出作為一種新的有前途的抗癌治療方法。在CAP誘導的細胞死亡中已經揭示了細胞凋亡和壞死，但是CAP是否誘導細胞焦亡仍然未知。Yang等[36]研究發現CAP通過線粒體途徑的激活（JNK/細胞色素C/Caspase-9/Caspase-3）和GSDME的裂解，在高表達GSDME的腫瘤細胞系中以劑量依賴性方式有效誘導了細胞焦亡，揭示了GSDME可能是未來癌癥CAP治療中預后的潛在生物標志物。在結直腸癌中，Yu等[37]發現，洛鉑呈劑量依賴性降低了HT-29和HCT116細胞的活力，從形態學上看，洛鉑處理的HT-29和HCT116細胞在顯微鏡下表現為細胞腫脹，細胞膜上出現大氣泡，透射電鏡顯示細胞膜上有多個孔。機制上，洛鉑誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高和JNK磷酸化。活化的JNK將Bax引入線粒體，刺激細胞色素c向細胞質釋放，進而誘導Caspase-3和Caspase-9裂解，從而發生細胞焦亡。Wang等[38]研究發現在胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45中使用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）可以誘導Caspase-3的裂解，從而使GSDME的N末端片段積累，導致胃癌細胞焦亡。此外，CRISPR-Cas9敲除GSDME可將5-FU誘導的Caspase-3依賴性焦亡轉變為凋亡。真核延伸因子-2激酶（eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF-2K）是一種蛋白合成的負調控因子，已被證明在各種應激下腫瘤細胞自噬和凋亡中發揮重要作用[39]。在最近的一項研究中，eEF-2K在阿霉素誘導的人類黑色素瘤細胞焦亡中發揮重要作用，eEF-2K沉默導致焦亡作用增強，從而使黑色素瘤細胞對阿霉素敏感，表明靶向eEF-2K可能增強阿霉素的抗腫瘤作用，為腫瘤化療提供了新的方向[40]。

4小結

細胞焦亡是新近發現的一種促炎性、程序性細胞死亡方式。經典細胞焦亡途徑依賴于Caspase-1的介導，非經典細胞焦亡途徑依賴于Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的介導。經過近年的研究，焦亡的特征已有較一致的認識，機制研究也取得的重大突破，多項研究也表明了細胞焦亡參與了各種疾病的發展。目前對于不同疾病中細胞焦亡發生的機制尚未完全明確，進一步探究細胞焦亡在不同疾病，特別是腫瘤中的效應機制，以及相關上下游信號轉導通路的蛋白，對于全面認識這一新型的細胞死亡方式，對于新型藥物的開發，尋找疾病治療的新靶點具有重要意義。

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（收稿日期：2020-06-22）