精索靜脈曲張術后聯合不同抗氧化劑對精子DNA碎片率的影響

鄧 浩 李 煥 趙 軍 鐘玉城 馬文敏

南方醫科大學附屬佛山市婦幼保健院生殖中心（廣東佛山 528000）

精索靜脈曲張（Varicocele，VC）是是男性泌尿生殖系統常見疾病，在普通成年男性中發病率為10%-25%，精液異常男性中發病率約25.4%[1]。目前，許多研究已經證實，精索靜脈曲張會影響男性精液質量，從而引起男性不育。作為遺傳信息的載體，精子DNA完整性對于生育健康后代具有重要意義，而精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）正是反映精子 DNA完整性的一個重要參數，在男性生育力評估及輔助生殖技術的有著重要作用[2-4]。目前已有許多研究顯示精子DNA完整性會影響男性生育能力，當精子DNA碎片率顯著升高時，男性生育能力將明顯下降[5-6]。

精索靜脈曲張從多個病理生理方面影響男性精子DNA完整性，其中氧化應激損傷是重要影響因素之一，氧化應激可以導致精子DNA碎片率升高。我們前期研究已證實，精索靜脈曲張術后可以降低精子DNA碎片率，提高精液質量[7]。維生素E及輔酶Q10作為重要的抗氧化劑，在機體抗氧化系統中發揮著重要作用。有研究表明，維生素E、輔酶Q10可以改善不育男性精液質量，降低精子DNA碎片率[8-9]。本次研究中，我們將探討精索靜脈曲張術后聯合不同的抗氧化劑對精子DNA碎片率產生的影響。

資料與方法

一、研究對象

選擇2018年01月至2019年12月在南方醫科大學附屬佛山市婦幼保健院輔助生殖技術中心男科就診的精索靜脈曲張同時伴精子DNA碎片率升高的患者332例。納入標準：1、精子DNA碎片率升高，DFI＞15%，2、臨床I度曲張伴精液質量異常、臨床II度曲張、臨床III度曲張，3、彩色多普勒超聲（CDFI）確認精索靜脈血液存在返流。排除標準：1、無精子癥；2、隱睪；3、睪丸炎、附睪炎；4、遺傳系統疾病；5、近期接觸高溫、射線、毒物等；6、不能耐受手術。

二、研究方法

332例精索靜脈曲張患者采取隨機數表法分為3組，對照組：共107例，患者行精索靜脈曲張手術，術后不予藥物治療。維生素E組：共115例，患者行精索靜脈曲張手術，術后給予天然維生素E口服，每日2次，每次100mg，連續服藥3個月。輔酶Q10組：共110例，患者行精索靜脈曲張手術，術后給予輔酶Q10口服，每日2次，每次100mg，連續服藥3個月。所有患者于手術前及手術后3個月行精液分析及精子DNA碎片率檢測。

三、手術方法

麻醉后，常規消毒鋪巾。于內環口處作橫切口長約3cm，依次切開皮膚、皮下、腹外斜肌腱膜，逐層分開腹內斜肌、腹橫肌、腹橫筋膜后見腹膜外間隙，使用拉鉤將腹膜向內側推開，暴露緊貼腹膜的精索，分離后用靜脈拉鉤將精索拉出切口外。顯微鏡下一般可見3-6支靜脈，最粗靜脈直徑可達5mm；動脈1-2支，平均直徑約1mm。顯微器械小心游離睪丸動脈，其余精索靜脈等組織在顯微鏡下以5-0或4-0絲線精細結扎。于近睪丸端剪開較大的曲張靜脈排出睪丸端淤積的靜脈血，以絲線關閉靜脈排血口。尋找結扎后膨大透亮的淋巴管，最大直徑可達1-3mm，使用眼科剪將淋巴管開窗，可見清亮淋巴液流出，膨大的淋巴管腔扁塌、變細。檢查無活動性出血后，逐層關閉切口。

四、精索靜脈曲張的診斷及分度

臨床型Ⅰ度：陰囊觸診時無異常，但患者屏氣增加腹壓（Valsava試驗）時可捫及曲張的精索靜脈；臨床型Ⅱ度：陰囊觸診時可捫及曲張的精索靜脈；臨床型Ⅲ度：視診可以看見陰囊內曲張靜脈團塊，陰囊觸診時可捫及明顯增大、曲張的靜脈團[1]。

五、計算機輔助精液分析（CASA）

嚴格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》進行精液分析操作，采用計算機輔助全自動精液分析儀（IVOS分析儀，美國Hamilton公司）進行精液分析，精子畸形率由同一實驗室工作人員進行操作判定。

六、精子DNA碎片率檢測

采用精子染色質結構分析法 （sperm chromatin structure assay，SCSA），用《精子核完整性染色試劑盒》（浙江星博生物科技股份有限公司）進行DNA碎片率檢測。取精液標本在顯微鏡下觀察計數，根據計數的精液濃度，取一定量精液用三羥甲基氨基甲烷氯化鈉EDTA緩沖液將精液標本稀釋至濃度為1-2×l06/ml的精子懸液。取稀釋的精子懸液0.01-0.02ml直接涂片，將玻片置于液缸中，干燥后加入0.2ml酸溶液孵育30秒，加入0.6ml吖啶橙溶液進行避光染色。放入流式細胞儀進行分析檢測，3分鐘內檢測2次，每次檢測5000個精子，流速控制在200-300微粒/秒。最后應用流式圖形軟件分析，得出精子DNA碎片所占的百分比例。DFI≤15%為正常參考值；DFI＞15%為精子DNA碎片率升高。

七、統計學分析：

結 果

一、三組患者一般情況比較

對照組、維生素E組及輔酶Q10組患者的年齡無統計學差異（33.13±6.93 歲 VS 31.77±6.48 歲 VS 32.64±7.21歲，P＞0.05），三組患者左側、右側、雙側精索靜脈曲張的比例及臨床I度、II度、III度的比例，差異無統計學意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 三組患者一般情況比較(±s;n,%)

表1 三組患者一般情況比較(±s;n,%)

三組之間差異無統計學意義，P＞0.05

分組 n 年齡（歲） 左側曲張 右側曲張 雙側曲張 I度曲張 II度曲張 III度曲張對照組 107 33.13±6.93 102（95.33%） 1（0.93%） 4（3.74%） 13（12.15%） 76（71.03%） 18（16.82%）維生素E 組 115 31.77±6.48 108（93.91%） 2（1.74%） 5（4.35%） 12（10.43%） 81（70.43%） 22（19.13%）輔酶 Q10組 110 32.64±7.21 105（95.45%） 2（1.82%） 3（2.73%） 15（13.64%） 78（70.91%） 17（15.45%）

二、三組患者精子DNA碎片率比較

三組患者手術前精子DFI水平無明顯差異（26.15±10.68%VS 27.47±10.85%VS 25.82±11.39%，P＞0.05），三者患者手術后精子DFI水平較手術前均明顯下降（21.52 ±8.98%VS 26.15 ±10.68% ；16.54 ±9.23%VS 27.47±10.85% ；17.27±9.71%VS 25.82±11.39% ，P＜0.05），維生素E組及輔酶Q10組手術后精子DFI水平低于對照組手術后精子DFI水平（16.54±9.23%、17.27±9.71%VS 21.52±8.98%，P＜0.05）（表 2）。

表2 三組患者手術前后精子DFI水平比較(±s)

表2 三組患者手術前后精子DFI水平比較(±s)

與各組手術前相比：*P＜0.05；與對照組手術后DFI相比：#P＜0.05

組別 n 手術前DFI（%） 手術后DFI（%）對照組 107 26.15±10.68 21.52±8.98*維生素 E 組 115 27.47±10.85 16.54±9.23*#輔酶 Q10 組 110 25.82±11.39 17.27±9.71*#

三、三組患者精液參數比較

三組患者手術后精液量與手術前相比，無明顯變化（P＞0.05）。三組患者手術后精子濃度、存活率、PR均較手術前顯著提高（P＜0.05）。維生素E組及輔酶Q10組手術后精子畸形率較手術前改善（P＜0.05），對照組手術后精子畸形率較術前無明顯變化（P＞0.05）。維生素E組及輔酶Q10組手術后精子濃度、存活率、PR及畸形率較對照組手術后有明顯提高（P＜0.05）（表3）。

表3 三組患者手術前后精液參數比較(±s)

表3 三組患者手術前后精液參數比較(±s)

與各組手術前相比：*P＜0.05；與對照組手術后相比：#P＜0.05

手術后對照組 維生素E組 輔酶Q10組 對照組 維生素E組 輔酶Q10組精液量（ml） 3.83±1.13 4.21±1.22 4.09±1.27 4.08±1.09 4.23±1.17 4.31±1.21濃度（×106/ml） 47.64±32.28 44.53±29.71 43.28±34.09 64.73±39.45* 76.32±36.71*# 79.23±42.26*#存活率（%） 52.63±11.30 50.16±10.82 54.24±11.89 62.46±12.56* 71.43±11.87*# 69.64±10.98*#PR（%） 27.81±10.62 27.06±11.57 28.60±11.04 34.76±11.03* 42.32±12.52*# 41.72±10.25*#畸形率（%） 97.74±8.04 97.34±8.71 98.14±9.18 96.74±9.14 93.40±8.95*# 94.68±10.03*#組別 手術前

討 論

精索靜脈曲張是導致男性不育最常見的疾病之一，可通過多種病理生理改變影響睪丸功能，其中腎靜脈血液反流學說被認為是最可能的原因。來自腎靜脈的反流靜脈血可引起睪丸溫度和靜脈壓升高，將腎和腎上腺的毒性代謝產物帶至睪丸，導致睪丸的生精功能受損[10]。其中，反流靜脈血液中含有的較高水平的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）被認為是影響睪丸生精功能以及精液質量的重要因素之一[11]。通常情況下，精漿正常水平的ROS在精子運動獲能及精卵結合中發揮了重要作用[12]。精索靜脈曲張可導致精漿ROS的生成超過機體內抗氧化系統清除能力，過高的ROS介導的氧化應激反應可引精子DNA的損傷。有學者研究ROS和精液參數、精子DNA碎片率的關系，認為精索靜脈曲張患者ROS水平與精子DFI及精液參數有顯著相關性，精索靜脈曲張患者精漿中ROS水平以及DFI均明顯升高，且與VC嚴重程度呈正相關[13]。精子DFI顯著升高可導致男性不育，并且與配偶反復流產、輔助生殖妊娠率密切相關[14]。因此，對于有明確手術指征的VC，建議手術治療。

維生素E又稱生育酚，是重要的抗氧化劑之一。維生素E通過終止生物膜和膜蛋白的脂質過氧化反應發揮其作用，可以改善由ROS和脂質過氧化的氧化應激損傷[15]。許多研究發現，補充維生素E可以提高男性精子濃度，改善精子活動力及形態，從而提高男性生育能力[16-18]。輔酶Q10是線粒體呼吸鏈關鍵組件，在維持細胞膜和脂蛋白代謝中發揮重要作用。輔酶Q10能夠對抗脂質過氧化損傷，同時促進線粒體能量的生成[19]。有研究表明，精漿的抗氧化能力與精子的運動性呈正相關，采用輔酶Q10 200mg/d口服，連續服藥12周后能夠顯著增強精漿的抗氧化能力[20]。還有學者研究顯示，采用輔酶Q10 300mg/d口服，連續服用12個月，精子的濃度、前向運動百分率及正常形態百分率較用藥前顯著改善[21]。因此，口服維生素E、輔酶Q10等抗氧化劑能夠減輕由精索靜脈曲張造成ROS增加而導致的氧化應激損傷，減少精索靜脈曲張患者精子DNA的損傷，降低精子DNA碎片率[22-23]。

我們納入精索靜脈曲張伴精子DNA碎片率升高的患者，研究精索靜脈曲張術后聯合使用不同的抗氧化劑對精子DNA碎片率及精液質量的影響。我們的研究結果顯示，三組患者手術后精子DFI均較手術前有明顯下降，證實精索靜脈曲張手術的確可以降低精子DNA碎片率，與Kadioglu及Alhathal的研究的結果相符[24-25]。 Ni及 García-Peiró等研究認為，對于伴有精子DNA碎片率升高的VC患者，手術有助于減少ROS損傷，降低精子DNA碎片率，改善精液質量，提高妊娠率[26-27]。我們通過對比三組患者術前術后精液參數，三組患者手術后精液量與手術前相比，無明顯變化。三組患者手術后精子濃度、存活率、PR均較手術前顯著提高，證實精索靜脈曲張患者行手術治療可以提高精子質量。通過對比術后三組精子DNA碎片率的結果，我們發現維生素E組及輔酶Q10組精子DNA碎片率低于對照組，表明精索靜脈曲張術后聯合維生素E及輔酶Q10可以進一步降低精子DNA碎片率。可能與術后使用維生素E、輔酶Q10等抗氧化劑后，可以減輕ROS造成的氧化應激損傷有關[28-29]。通過對比對照組手術前后精子畸形率，發現精索靜脈曲張手術前后精子畸形率無明顯差別，精索靜脈曲張手術并不能很好的降低精子畸形率。當術后聯合使用維生素E及輔酶Q10后精子畸形率較手術前有了改善。

綜上所述，對于精索靜脈曲張伴精子DFI升高的患者，建議行手術治療，手術可以降低精子DFI，提升精子質量。術后可以考慮聯合使用維生素E及輔酶Q10等抗氧化劑，可以進一步改善精液質量。