龍葵生物堿對結腸癌DLD-1細胞增殖及凋亡的影響

周 曉，靳貝貝，樊東升，段秀俊，胥鵬鵬

（1.山西中醫藥大學，山西晉中030619； 2.山西中醫藥大學中西醫結合醫院，山西太原030006）

龍葵（Solanum nigrumL.），又名苦葵、苦菜、天茄子等，屬于一年乃至多年生的雙子葉茄科茄屬草本植物，分布廣泛，應用歷史悠久，可追溯于《唐本草》。歷代醫書對龍葵功效的描述包括清熱解毒、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰；其性味歸經則總結為性寒，味苦、微甘，有小毒，歸肺、腎經。根據龍葵具體的功效，現代臨床多用于治療感冒發熱、咳嗽、牙痛、高血壓、慢性支氣管炎以及急性腎炎、泌尿系感染、細菌性痢疾、丙型肝炎病毒等細菌病毒感染類疾病［1］。近代研究發現龍葵對于腫瘤細胞、病毒以及細菌等微生物有較好的抑制作用，可用于抗腫瘤、抗菌和抗病毒的治療。此外，部分研究結果表示，龍葵還具有調節神經和內分泌的作用［2-5］。本研究采用體外細胞實驗的方法，用于觀察龍葵生物堿對人體結腸癌DLD-1細胞增殖及凋亡的影響，為龍葵的抗腫瘤作用提供實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物與細胞株 龍葵總生物堿：實驗室自制。對數生長期（細胞代謝活性強，數量呈對數生長）的結腸癌DLD-1細胞由山西醫科大學微生物與免疫實驗室提供。

1.1.2 實驗儀器 超聲波清洗機（SB-5200DTDN，寧波新芝生物科技有限公司），4℃/-20℃冰箱（BCD-568WDPF，海爾有限公司），超凈工作臺（SW-CJ-2D，蘇州凈化設備有限公司），細胞培養箱（DNP-9082，上海精宏有限公司），-80℃超低溫冰箱（DW-86L388A，海爾有限公司），全自動酶標儀（ELX808，Biotek），常溫低速離心機（Pico21，Thermo），水浴鍋（ThermoQ，杭州博日有限公司），流式細胞儀（Navios 10，美國Beckman Coulter公司），倒置熒光生物顯微鏡（A1，德國Zeiss公司），分析天平（Sartorious，德國賽多利斯公司）。

1.1.3 實驗試劑 90%乙醇（天津風船化學試劑），大孔樹脂LSA-10（171203，滄州寶恩化工有限公司），RPMI 1640培養基（BioReagent），PBS磷酸緩沖液 （Gibco），0.25%胰蛋白酶（1828S05，Amerso），青鏈霉素混合液（Gibco，201806），二甲基亞砜 DMSO（BioReagent，Sigma），新生牛血清（180910，杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8（201708，美國 AMRESO 公司），Annexin VFITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（20180126，江蘇凱基生物技術股份公司），AO-EB雙染試劑盒（Gibco）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 龍葵生物堿藥液：精密稱取龍葵生物堿提取物適量，加二甲基亞砜（DMSO）適量（最終含量控制在0.6%以下［6］），超聲作用溶解，加入完全培養基，將其配置成濃度為2 mg/mL的龍葵生物堿溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，120℃熱壓滅菌后，于4℃保存，使用時稀釋至所需濃度，即得。顯色液：將AO和EB兩種溶液按1∶1比例混合即可。

1.2.2 細胞培養 取結腸癌DLD-1細胞進行傳代培養，用PBS磷酸緩沖液緩慢沖洗細胞表面，移除PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液置于細胞培養箱中消化3 min，后加入RPMI 1640培養基終止消化，并將細胞懸液轉移至離心管內，采用1000 r/min的速率離心5 min，棄去上清液，吸取沉淀物并加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的1640培養基混懸細胞，放置于37℃含有5%CO2的細胞培養箱中培養至完全貼壁，即可。

1.2.3 CCK-8法考察對細胞增殖的影響 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，以吸管吹打均勻，按照每孔500個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，將 96孔板放置于 37 ℃、含有 5%CO2的細胞培養箱中培養至細胞完全貼壁后進行分組。分為給藥組（0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.2mg/mL，1.4 mg/mL 5個濃度梯度的生物堿溶液）與空白對照組（含10%血清的培養基）。每組3個復孔，每孔 100 μL，繼續培養 24 h，移除 96孔板中的溶液，在每孔內加入含10%CCK-8的RPMI 1640培養基溶液100 μL，放置細胞培養箱中繼續培養1～2 h，取出，終止培養，使用酶標儀于450 nm波長下測吸光度，記錄各孔的OD值，并計算各組的細胞增殖抑制率。抑制率=（1-給藥組的OD值/空白對照組的OD值）×100%。

1.2.4 AO-EB雙染色熒光顯色法觀察細胞形態 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，采用顯微鏡計數法將細胞濃度調整為5×105個/mL，將其置于6孔板中，每孔加入2 mL的RPMI 1640培養基后，將6孔板放入細胞培養箱中培養。待細胞貼壁生長至約80%左右時移除培養基，在孔內分別加入濃度為 0.6 mg/mL、1.0 mg/mL、1.4 mg/mL 的龍葵生物堿溶液，而空白對照組加入RPMI 1640培養基溶液。繼續培養48 h后，移除培養基，使用PBS磷酸緩沖液沖洗2次，后每孔中加入2 mL新鮮PBS溶液，避光加入事先配好的顯色液40 μL，室溫放置 2～5 min，置熒光顯微鏡下觀察，并拍照［7］。

1.2.5 流式細胞法考察對細胞凋亡的影響 取“1.2.2”項下制備的細胞混懸液，置于37℃、含有5%CO2的細胞培養箱中培養，待細胞貼壁完全后分為 4組，給藥組 3組（0.6 mg/mL，1.0 mg/mL，1.4mg/mL）與空白對照組（含10%血清的培養基）。待細胞給藥24 h后，使用PBS溶液沖洗1次，加胰蛋白酶消化細胞5 min，放入低速離心機以1000 r/min的速率離心5 min。棄去上清液，將沉淀物制成細胞濃度為（2～5）×105個/mL的細胞懸液。再加入100 μL的Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL的 PI Staining Solution混合均勻，室溫條件下避光孵育15 min。之后加入200 μL 的 Binding Buffer，搖勻，流式細胞儀檢測［8］。

1.3 數據分析

采用SPSS 13.0軟件包進行分析，數據均以均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 龍葵生物堿對DLD-1細胞增殖的影響

各濃度龍葵生物堿對結腸癌DLD-1細胞均有抑制作用，隨著給藥濃度的增大，細胞抑制率隨之增強，IC50值為0.94 mg/mL。龍葵生物堿不同濃度組與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

表1 龍葵生物堿對DLD-1腫瘤細胞增殖的抑制作用 （x ±s）

2.2 龍葵生物堿對DLD-1細胞形態的影響

空白對照組細胞形態飽滿，數量較多；各給藥組大部分細胞形態發生明顯變化，呈現不同程度的固縮狀，變圓且體積縮小，且數量有所減少。結果見圖1。

圖1 龍葵生物堿對細胞形態的影響

2.3 龍葵生物堿對DLD-1細胞凋亡的影響

各給藥組凋亡細胞數隨著龍葵生物堿質量濃度的升高，凋亡率逐漸上升，表明龍葵生物堿呈濃度依賴性誘導DLD-1細胞凋亡。結果見圖2。

圖2 龍葵生物堿對細胞凋亡的影響

3 討論

結腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，屬于第三大胃腸道腫瘤，全球每年有近50萬人死于此病。美國腫瘤協會調查數據顯示，結腸癌的發病率以及死亡率排在各類腫瘤的前列，2016年約數十萬例患者因結腸癌離世［9］。由于結腸癌的高發病率與高死亡率，近年來，醫學工作者對結腸癌的預防與治療進行了大量的研究，發現運用中醫藥治療結腸癌，其有效成分可在一定程度上對結腸癌細胞生長和癌細胞轉移產生抑制作用，并對患者自身免疫力產生較為有效的積極作用，這使得腫瘤細胞凋亡速率增快，進一步抑制了腫瘤基因的表達。但對于中藥治療結腸癌的具體分子機制仍不夠明確，有待進一步探索，以便更加準確有效地應用于腫瘤的預防和治療［10-11］。

龍葵作為我國傳統的中藥，作用廣泛，效果明顯，應用可追溯到《唐本草》，而近代大量醫學實驗研究也證實了龍葵中含有豐富的生物堿、皂苷等大量的可用于癌癥治療的有效成分，可用于乳腺癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤的治療。

CCK-8結果顯示，龍葵生物堿對結腸癌DLD-1細胞有抑制增殖的作用，且在一定給藥范圍內隨龍葵生物堿濃度的增加，抑制效果增強，在給藥濃度為1.4 mg/mL時，細胞增殖抑制率可達（77.87±0.39）%，細胞的半數抑制濃度為0.94 mg/mL。AO-EB與細胞凋亡實驗結果顯示，龍葵生物堿可誘導DLD-1細胞凋亡，細胞形態與數量發生改變，且細胞凋亡率隨著龍葵生物堿濃度的升高而增大。綜上所述，在一定劑量范圍內，龍葵生物堿對DLD-1細胞的增殖產生影響，但其作用機制仍需進一步研究。