甘草附子湯對小鼠疼痛模型及寒濕證疼痛模型止痛作用比較研究

靳 荃，青千裕，郜憲明，趙子葦，趙 樂，李艷彥，王永輝，孫力威

（1.山西中醫藥大學，山西晉中030619； 2.香港浸會大學中醫藥學院，香港999077）

甘草附子湯出自《傷寒雜病論》117條，“風濕相搏，骨節疼煩，掣痛不得屈伸，近之則痛劇，汗出短氣，小便不利，惡風不欲去衣，或身微腫者，甘草附子湯主之”。該方由炙甘草、炮附子、白術、桂枝四味藥組方而成，具有祛風除濕、溫經散寒、溫陽補中的功效。小鼠熱板法與小鼠扭體法是經典的藥理學疼痛模型，可從不同角度證明藥物的止痛作用。關于中藥及藥物有效成分止痛實驗的文獻報道較多［1-2］，但極少有文獻報道方劑對中醫病證結合模型止痛實驗方面的研究［3］。本研究擬通過研究甘草附子湯對小鼠經典疼痛模型與寒濕證疼痛模型的止痛作用，探究方劑與中醫證候模型之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與動物 塞來昔布（輝瑞制藥有限公司，J20140072）；醋酸溶液（國藥集團化學試劑公司，20150607）。SPF 級 CD-1（ICR）小鼠 140只，雌性，6～8 周齡，體質量（28±5）g，SCXK（京）2016-0006，北京維通利華實驗動物中心提供。溫度（19±2）℃，濕度40%～60%，飼養于山西中醫藥大學實驗中心，適應性喂養1周，期間充足攝食、攝水。

1.1.2 實驗儀器 DHP-9082B型恒溫箱（上海一恒公司），RB-200智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱板實驗

1.2.1.1 中藥復方制備 甘草附子湯組成按《金匱要略》原方劑量換算（1兩=3 g），煎煮2次，合并濾液，并濃縮至含生藥劑量5 g/kg，冰箱保存備用。

1.2.1.2 熱板實驗前小鼠篩選 雌性小鼠80只，放入溫度已控制好的熱板儀上（55±0.5）℃，立即開始計時，并蓋上有機玻璃罩避免小鼠躍出，仔細觀察，待小鼠舔后足時馬上停止計時。開始舔腳時間在10～30 s之間為正常痛閾值，其他時間段均剔除，小鼠有跳躍的情況也剔除。篩選痛閾值合格的小鼠60只，間隔5 min后，再次測定痛閾值，以2次平均值作為小鼠給藥前的正常痛閾值。

1.2.1.3 分組與給藥 將符合條件的小鼠60只，采用隨機數字表法分為6組，對照組、甘草附子湯組、塞來昔布組、寒濕證模型組、寒濕證甘草附子湯組、寒濕證塞來昔布組，每組10只。小鼠寒濕證模型的建立：除對照組、甘草附子湯組、塞來昔布組外，其余各組小鼠每日上午9點開始于水溫（14.0±0.5）℃水中游泳至力竭下沉時撈出，下午2點將小鼠置于人工氣候箱［溫度：（4±0.5）℃，濕度：90%～95%）］中 4 h［4-5］，連續刺激 15 d。除對照組及寒濕證模型組灌胃生理鹽水外，其余組灌胃相應藥物：甘草附子湯劑量為10.92 g/kg，塞來昔布膠囊以蒸餾水溶解，濃度為30.04 mg/kg，灌胃容積為0.15 mL/10 g，每天1次，連續15 d。

1.2.1.4 觀察指標 灌胃結束后，在安靜的環境中，分別測定各組小鼠灌胃后45 min、90 min、135 min、180 min時小鼠的痛閾值。將各組小鼠放入溫度已控制好的熱板上（55±0.5）℃，立即開始計時，并蓋上有機玻璃罩避免小鼠躍出，仔細觀察，記錄各組小鼠開始舔腳時間，待小鼠舔后足時馬上停止計時。若小鼠放入熱板儀中60 s仍無反應，痛閾值按60 s計。

1.2.2 扭體實驗

1.2.2.1 分組與給藥 方法同1.2.1.1。小鼠寒濕證模型的建立同1.2.1.3。

1.2.2.2 觀察指標 各組小鼠末次灌胃30 min后，腹腔注射0.6%冰乙酸（0.1 mL/10 g），立即將小鼠單只放入籠內，觀察15 min內小鼠出現扭體反應的潛伏期（注射冰乙酸后至第一次扭體反應出現的時間）和扭體次數。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，統計分析采用重復測量方差分析法，多組間比較采用完全隨機設計方差分析法（ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況

對照組小鼠口唇紅潤，毛發光澤，對外界刺激反應靈敏，體重逐漸增高。寒濕證小鼠造模期間，逐漸出現大便變稀，體重升高變慢，毛發顏色變暗。造模15 d后小鼠毛發不澤，甚至稀疏粗糙，小鼠狀態萎靡，嗜睡，對外界刺激反應較慢，飲食減少，體重增加較慢，足趾及尾巴顏色變淺甚至出現瘀斑，大便稀。給藥后寒濕證塞來昔布組小鼠毛色逐漸恢復光澤，足趾顏色淺灰，瘀斑減輕，仍大便偏稀，皮膚青灰。給藥后寒濕證甘草附子湯組毛發開始有光澤，足趾顏色恢復正常，在籠內活動增多，飲食量變大，大便在給藥后第5天即由稀溏變為正常。

2.2 熱板實驗

2.2.1 甘草附子湯對小鼠疼痛出現時間的影響 與對照組比較，在給藥后90 min塞來昔布組舔腳時間延長（P＜0.05）；與寒濕證模型組比較，在給藥后135 min寒濕證甘草附子湯組舔腳時間變長（P＜0.01）。與甘草附子湯組比較，在給藥后180 min，寒濕證甘草附子湯組、寒濕證塞來昔布組舔腳時間變長（P＜0.05）。結果見表 1。

2.2.2 尾巴情況 造模第7天，寒濕證模型組及寒濕證塞來昔布組、寒濕證甘草附子湯組小鼠尾巴皮膚均變暗，顏色發青。造模第15天，以上各組小鼠尾尖顏色變青，甚至出現尾尖壞死情況。給藥后寒濕證塞來昔布組小鼠尾巴顏色未恢復正常。寒濕證甘草附子湯組小鼠給藥10 d后尾巴顏色即恢復正常。

2.2.3 關節、皮膚變化 造模第7天，寒濕證模型組及寒濕證塞來昔布組、寒濕證甘草附子湯組部分小鼠出現足背顏色變深，有水腫出現；造模第15天，更多小鼠出現足背水腫情況，甚至部分小鼠出現趾端壞死情況。給藥15 d后，寒濕證塞來昔布組小鼠足背水腫程度變輕，顏色稍顯青黑；寒濕證甘草附子湯組足背水腫消失，顏色恢復紅潤。

2.2.4 大便情況 對照組小鼠糞便呈顆粒狀，中等硬度。在造模第5天，寒濕證模型組、寒濕證塞來昔布組和寒濕證甘草附子湯組部分小鼠出現糞便不成形或稀溏；給藥15 d后，寒濕證甘草附子湯組大便逐漸變硬，寒濕證塞來昔布組小鼠大便普遍偏稀，僅有少部分大便成形。

表1 甘草附子湯對小鼠疼痛出現時間的影響 （s，±s）

表1 甘草附子湯對小鼠疼痛出現時間的影響 （s，±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與寒濕證模型組比較，2）P＜0.05；與甘草附子湯組比較，3）P＜0.05

組別 n對照組 10甘草附子湯組 10塞來昔布組 10寒濕證模型組 10寒濕證甘草附子湯組 10寒濕證塞來昔布組 10開始舔腳時間給藥后45 min 給藥后90 min 給藥后135 min 給藥后180 min 12.12±3.24 13.29±4.72 12.63±3.49 17.88±5.68 13.49±5.08 16.07±7.55 18.80±7.43 14.57±4.26 15.14±3.95 18.75±2.991） 19.70±4.54 23.28±7.76 12.19±3.53 14.93±4.08 15.57±3.53 17.08±5.21 14.81±3.60 16.73±2.56 22.52±8.482） 21.93±3.743）14.14±8.24 15.07±5.61 18.20±6.68 22.21±5.533）

2.3 甘草附子湯對寒濕證疼痛模型小鼠扭體實驗的影響

與對照組比較，塞來昔布組扭體次數減少（P＜0.05），扭體潛伏期時間延長（P＜0.01）；與寒濕證模型組比較，寒濕證塞來昔布組小鼠扭體次數減少、潛伏時間延長（P＜0.05），寒濕證甘草附子湯組扭體次數減少（P＜0.01）。與甘草附子湯組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數減少、潛伏時間延長（P＜0.05）。結果見表 2。

表2 甘草附子湯對寒濕證疼痛模型小鼠扭體實驗的影響 （±s）

表2 甘草附子湯對寒濕證疼痛模型小鼠扭體實驗的影響 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與寒濕證模型組比較，3）P＜0.05；與甘草附子湯組比較，4）P＜0.05

組別 n對照組 10甘草附子湯 10塞來昔布組 10寒濕證模型組 10寒濕證甘草附子湯組 10寒濕證塞來昔布組 10扭體次數（次） 潛伏時間（s）37.20±3.97 14.34±1.22 32.70±6.54 14.02±2.07 29.70±7.661） 15.22±1.142）36.70 ±6.06 14.18±0.97 28.50 ±4.654） 16.20±1.624）32.10 ±4.253） 15.39±0.703）

3 討論

實驗結果顯示，與寒濕證模型組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數減少（P＜0.01），且在給藥后 135 min舔腳時間變長（P＜0.01）；與甘草附子湯組比較，寒濕證甘草附子湯組扭體次數減少、潛伏時間延長（P＜0.05），且在給藥后 180 min舔腳時間變長（P＜0.05）。由此可以得出，甘草附子湯對寒濕證疼痛模型的止痛作用更加顯著。

甘草附子湯由炙甘草、炮附子、白術、桂枝四味藥組成。方中炙甘草味甘性溫，既可補中益氣，又可緩急止痛；附子味辛甘性大熱，可溫陽散寒定痛；白術味甘性溫，益氣健脾，性燥又可祛除濕邪；桂枝味辛甘性溫，有祛風散寒、溫通經絡之功。諸藥相伍，寒邪得散，濕滯得除，經絡得通，疼痛可止。故本方對寒濕證疼痛有良好的治療作用。現代實驗研究表明，甘草對拘急疼痛小鼠有抑制作用［6］；不同方法炮制的附子對熱板法及扭體法小鼠均具有一定鎮痛作用［7］；甘草附子湯中黑順片配伍甘草能夠抑制炎性細胞的分泌，有一定的鎮痛作用［5］；白術具有一定的鎮咳、祛痰及鎮痛作用［8］；桂枝對小鼠扭體反應具有一定的抑制作用［9］。甘草附子湯中的四味藥，均有止痛作用，對于熱板實驗和扭體實驗所引起的疼痛都有不同程度的抑制作用。甘草附子湯的主要藥理成分為烏頭堿、甘草苷、甘草異素等，甘草苷可降低烏頭堿的毒性，加強烏頭堿的止痛作用；甘草異素可緩解平滑肌痙攣［10］。白術、甘草和桂枝與附子同煮，可促進附子中的生物堿溶出［11］。可見甘草附子湯主要由烏頭堿和甘草異素發揮作用，達到止痛的作用。臨床研究表明，甘草附子湯能夠迅速改善寒濕痹阻型急性痛風性關節炎癥狀，可有效降低C反應蛋白水平，具有良好的鎮痛作用［13］。

小鼠熱板法是由于溫度刺激小鼠足爪引起小鼠疼痛中樞興奮產生痛覺，小鼠通過舔腳以減輕疼痛。經過寒濕環境的持續刺激，寒濕證模型小鼠在造模成功后，寒濕之氣凝結體內，對熱的刺激更加耐受，尤其是在給藥90 min之后，寒濕證模型各組舔腳時間均變長。甘草附子湯有溫陽散寒之功，且甘草附子湯藥物都有一定的止痛作用，故寒濕證小鼠灌胃甘草附子湯后止痛作用更為明顯。小鼠扭體法是由于小鼠腹腔注射冰醋酸刺激腹腔內組織引發腹腔炎癥反應，與外周神經相關，小鼠腹腔內組織受刺激后自發通過扭動身體以減輕疼痛刺激。甘草附子湯作用于寒濕證模型疼痛小鼠在散寒祛濕的同時又通絡止痛，可減輕小鼠腹腔內刺激而減輕疼痛。

中醫學認為疾病的發生是由于人體氣血陰陽失衡，從而表現出一類癥狀，這一類癥狀可以歸納為一個或多個證候，選擇與證候相應的方劑或藥物治療疾病，就是“方證相應”［13-14］。張仲景在《傷寒論》中言“觀其脈癥，知犯何逆，隨證治之”，就是要把握疾病之后隱藏的證候。方劑發揮治療作用與中醫證候之間密切相關，甘草附子湯有散寒除濕止痛之功，用于寒濕證疼痛有更好的治療作用，此研究為方證相關理論提供了實驗依據。