除病毒過濾可優化點探討

文/ 李世燕

單克隆抗體下游純化步驟一般包括親和捕獲、低pH 病毒滅活、中度純化、精細純化、除病毒過濾、超濾換液——其中，由于除病毒過濾器的價格昂貴和一次性使用的特性，導致除病毒過濾占用了整個生產工藝的很大一部分成本。因此，優化除病毒過濾器的載量顯得格外重要。如今，白帆生物已經完成了2 個項目的工藝優化實驗，這兩個項目都著重提高了除病毒過濾器的載量，且兩個項目即將進行2 000 L 的生產。本文從白帆生物優化除病毒過濾器載量經驗而來。

現行法規要求在生物制藥制造過程中至少使用2 種不同的方法去除病毒[1]，我們常用的病毒去除/滅活的方法就是除病毒過濾和低pH 病毒滅活法。低pH 病毒滅活法主要滅活脂包膜病毒。而非清除脂包膜病毒，如小白鼠病毒（MMV），通常通過物理方法實現分離，因為其對化學失活具有很高的抵抗力，因此需要除病毒濾膜來去除在生物制藥產品的純化過程中產生的非脂包膜病毒。除病毒過濾濾膜既可以去除非脂包膜病毒，也可以去除脂包膜病毒。

除病毒濾膜為死端過濾，截留大于孔徑的病毒顆粒，一般對于小于170 kDa 的蛋白產品，回收率大于98%。在病毒過濾過程中，常常有各種因素可能會導致過濾通量降低、濾器載量降低。本文探討了從濾器選擇、樣品pH與電導優化、樣品濃度選擇和添加劑選擇共4 個方面來優化濾器的載量，以達到降低生產成本、節省過濾時間的目的。

圖 1 不同材質濾器過濾某一蛋白的載量

濾器選擇

不同廠家的濾器材質不同，適合的蛋白產品也不同?，F有濾器材質一般分為3 類：PES、PVDF 和中空纖維素。在實驗中，分別使用這3 種材質的濾器過濾相同蛋白，且蛋白濃度相同，結果發現不同材質之間的過濾載量差別巨大[2]。如圖1 所示，中空纖維素膜載量＞PES 膜＞PVDF 膜，就此蛋白樣品而言，使用中空纖維素膜材質的濾器最合適。但若換了其他不同性質的蛋白，結果可能就完全相反，因此，需針對不同蛋白樣品選擇不同的濾膜材質。

圖 2 某樣品在不同pH 條件下的過濾載量

樣品pH 與電導率優化

樣品的pH 和電導率都有可能對除病毒濾器載量造成影響。如圖2 案例所示，對同一單抗產品使用相同濾器進行過濾，樣品濃度一致，分別在pH 為4.3 和5.3的條件下進行實驗。結果前者的過濾載量遠遠大于后者。電導率也同樣能對除病毒濾器造成如此大的影響。因此，需從實際出發，對最適pH、電導率進行考察以降低成本。

圖 3 某樣品在不同濃度下的過濾通量

樣品濃度選擇

生產過程中，在需要的蛋白量相同的情況下，蛋白濃度越高，樣品體積就越小，需要的儲液袋、儲液罐體積就越小，工藝時間也會縮短，因此工藝都在往高濃度方向發展。一般情況下，較高的蛋白濃度會導致較低的過濾速率。如圖3 所示，蛋白濃度為10.25 mg/mL 的通量從220 LMH迅速降低至10 LMH，而濃度為6.895 mg/mL 的蛋白樣品在此時仍有150 LMH 的通量。由此可見，就此工藝而言，樣品濃度為7 mg/mL 左右時過濾載量較優。若想找到最優范圍，仍需選擇其他濃度進行實驗。因此，除病毒過濾需要結合工藝時間、成本等因素找到合適的濃度范圍，優化性價比。

圖 4 Viresolve? Pro Micro Shield H 和Viresolve? Pro Micro Shield 適合的pH和電導率

添加劑選擇

若蛋白樣品不穩定，容易產生聚體，這會很大程度地影響除病毒濾器載量。我們可以通過添加氨基酸（精氨酸、組氨酸等）、糖類或者表面活性劑來穩定蛋白，從而提高濾器載量。

預過濾器的選擇

預過濾濾器對納濾過濾器的性能有很大的影響，使用得當可以明顯地減少納濾過濾器面積的使用。預過濾的目的是去除各種雜質、污染物，如蛋白質聚集物、DNA 和其他微量物質。不同的預過濾器處理的料液不同。如圖4 所示，Viresolve?Pro Micro Shield H 適合處理高pH、高電導率的樣品，而Viresolve?Pro Micro Shield 適合處理低pH、低電導率的樣品[3]。

預過濾器的面積大小也會對除病毒濾器載量造成很大的影響，越大的預過濾器面積會使除病毒濾器載量越大。如圖5 所示，預過濾與除病毒濾器比例為4:1 時，通量明顯大于比例為1:1 時。結合濾器價格分析，若選擇比例為4:1 時增加的預過濾器價格低于選擇比例為1:1 時除病毒濾器增加的價格，則可考慮選擇4:1 的比例進行除病毒過濾。

圖 5 預過濾器比例對某蛋白過濾載量的影響

圖6 白帆生物生產車間目前有2 條2 000 L 一次性生產線，未來可達6×2 000 L

總結

在本文中，我們探討了影響除病毒過濾器載量的不同因素，也分別舉了幾個例子來展示這些因素對載量可能的影響，從這些例子中我們可以看出濾器、樣品pH、電導率、樣品濃度、添加劑、預過濾器的不同都會對除病毒過濾造成不同的影響。若要使生產過程中除病毒過濾工藝成本最低，需綜合考慮各個因素的相互影響。

白帆生物生產車間目前有2條2 000 L 一次性生產線，未來可達6×2 000 L，如圖6 所示。除病毒過濾階段擁有Sartorius 的FlexAct VI 和FlexAct VR 兩臺設備，能全自動地進行低pH 病毒滅活和除病毒過濾操作。一次性的自動化操作單元，大大降低了污染風險，減少了樣品在不利環境中的暴露時間和不必要的清潔驗證，使得除病毒過濾操作更快速、安全、高效。

作為國內一次性使用技術與商業生產及CDMO 服務結合的時代領軍者，白帆生物與Cytiva和Satorius 等國際企業強強聯合，將“NONCROS 無交叉抗體工廠”的概念變為現實，引入現代化一次性使用系統生產線，建立了上海最大的單抗生產基地之一。該基地除了滿足集團內產品的生產需求，也致力于為同行提供單抗CDMO 服務，謀求共同發展。