黑曲霉高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的誘變、篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

孫智 郭金玲 龔大春 古永紅 文曉敏 劉君子 肖玲玲

【摘 要】文章主要是以黑曲霉TJ02為出發(fā)菌對其的孢子進行了硫酸二乙酯化學的誘變，同時對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，然后以玉米芯為主要碳源，對該菌株中的β-葡萄糖苷酶的溫度以及穩(wěn)定性展開了測試。

【關(guān)鍵詞】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;誘變

纖維素酶是一種多組分良好的酶系統(tǒng)。根據(jù)其誘導(dǎo)反應(yīng)的程度，它具有重要的功能。內(nèi)切葡聚糖酶（英文縮寫EG）、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷三種主要類型。酶（縮寫為BG）協(xié)同作用促進纖維素的降解而不產(chǎn)生長纖維聚糖和醛糖。這些糖最終被水解成糖。此外，β-糖苷酶將醋酸時間內(nèi)迅速釋放的纖維結(jié)構(gòu)半乳糖降解為肝糖原，促進其清除。抑制酶組分是水解過程的最后一步，也是受外界因素制約的最關(guān)鍵因素。纖維素酶的產(chǎn)生菌是木霉菌。所產(chǎn)酶系具有較高的斜葡萄糖寡糖和外源葡萄糖苷酶活性，但β-葡萄糖苷酶數(shù)量相對不足，生物降解效率和質(zhì)量較低。米曲霉具有獨特的高β-糖苷酶活性。在酶體系中加入該酶還可以大大提高富含纖維素的核桃木復(fù)合材的速度和效率。本研究通過硫酸二乙酯的化學誘變，獲得了一株遺傳基因相對穩(wěn)定的菌株。優(yōu)化了黑青霉β-糖苷酶高產(chǎn)突變株DES-7，并對其培養(yǎng)的碳源和氮源進行了優(yōu)化。確定了β-葡萄糖苷酶的最適pH和最適室內(nèi)溫度，并測定了其pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

1測定基本情況

1.1黑曲霉致死率的測定

用氯酸鹽人工誘導(dǎo)tj02黑曲霉。隨著漸進突變育種時間的延長，細胞質(zhì)的死亡率會增加。硫酸乙酯多倍體時間為10min時，孢子囊死亡率僅為23.2%;誘變育種時間延長至30min時，孢子囊死亡率提高到85.3%;化學誘變時間為40min時，卵死亡率為95.8%;50 min和60min時，孢子囊死亡率為95.8%，死亡率在60%以上。根據(jù)死亡率選定硫酸二乙酯，后續(xù)治療時間為30min[1]。

1.2高β-葡萄糖苷酶活菌株的誘變及篩選

用硫酸二乙酯處理的孢子囊懸浮液包被在PDA板上。隨機選擇25個突變株并將其疫苗接種在新的PDA平板設(shè)備上以進行重新分離和純化。通過刮除誘變環(huán)獲得的點突變菌株的孢子囊疫苗在次級發(fā)酵瓊脂培養(yǎng)基中進行二次發(fā)酵和連續(xù)培養(yǎng)。確定β-葡萄糖苷酶以進行初步篩選。突變體des-7和des-11的酶活性大大提高。

1.3遺傳穩(wěn)定性

通過這種初步篩選獲得的突變菌株DES-7和DES-11被連續(xù)培養(yǎng)了8代，并確定了親本的遺傳穩(wěn)定性。DES-7的β-葡萄糖苷酶活性比突變體DES-11的穩(wěn)定。與原始菌株TJ02相比，β-葡萄糖苷酶活性提高了30%以上[2]。

1.4碳源對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響

通過使用麩皮，芝麻桿，玉米芯（Wangetal，2011），木糖殘渣，油炸的麥稈，微晶纖維素等，將一系列最便宜易得的原料用作研究的主要原料，檢測其對β-葡萄糖苷酶對菌株的影響。當玉米芯用作碳源時，分離株發(fā)酵液中的中間蛋白和β-葡萄糖苷酶的生物活性最大，前者為0.48g/L和13.78IU/mL。緊接著進行蒸汽噴射的小麥，稻稈和麩皮，其次是玉米。核心是唯一的碳源。研究了相同高濃度對細菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的影響。以玉米芯為唯一底物，其濃度比對噬菌體產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的失活有重大影響。當玉米芯的濃度為50g/L時，β-葡萄糖苷酶活性達到39IU/ml10。902菌株的生產(chǎn)力將隨著玉米芯濃度比的增加而增加。這可能與絲狀真菌的高密度菌絲有關(guān)[3]。如果底物纏結(jié)的濃度太高，則二次發(fā)酵液相對較厚，這不利于分離物的產(chǎn)生。與小麥核心（50g/L）作為碳源相比，使用了天然的初始發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米芯核心麩為發(fā)酵底物時β-葡萄糖苷酶活作為28iu/ml），腸球菌的容量規(guī)模也很差。

1.5氮源對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響

在恒溫、氮氣濃度不變的前提下，以（NH4）2SO4、（NH4）2CO、NH4COOCH3、NH4Cl、NaNO3、干酵母粉、小麥充分攪拌和玉米蛋蛋白胨為兩種不同類型，8種成分成為研究芽孢桿菌對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響、（NH4）2SO4和復(fù)合肥在無機物氮源中對細菌酶的產(chǎn)生比三種組分更為不利;考慮到市場因素，（NH4）2SO4是最有利的無機復(fù)合氮源;發(fā)酵粉是最好的無機相氮源，初始瓊脂培養(yǎng)基中的氮源為（NH4）2SO4與酵母粉混合，發(fā)酵的最佳效果高于多種組分，說明（初始液體培養(yǎng)基中的（NH4）2SO4和酵母發(fā)酵粉效果。

1.6β-葡萄糖苷酶表觀酶學性質(zhì)研究

1.6.1 β-葡萄糖苷酶的最適溫度

為了更好地確定β-葡萄糖苷酶的最佳溫度，在不同攝氏度的基本條件下測量了β-葡萄糖苷酶的酶活性。當溫度降至55°C時，酶的活性可以達到最高。觀察β-葡萄糖苷酶活性的變化曲線：當總溫度低于55℃時，酶活性隨室內(nèi)溫度的升高而增加;當總溫度為60℃時，酶活性降低。當攝氏溫度超過70°C時，酶活性急劇上升，降至最佳總溫度的30%。

1.6.2 β-葡萄糖苷酶的最適pH

在pH為2.0-9.0的相同緩沖空間溶液中，準確地測定了β-過氧化物酶的活性物質(zhì)與pH的關(guān)系。由該菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷的活性隨pH而顯著變化，并且其酶活性pH4.0左右是最高的，表明菌株所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶是一種弱酸性的β-葡萄糖苷酶，它的最佳pH值約為4.8。

1.6.3 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性

測定β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性，并在37℃、50℃和65℃下測定β-葡糖苷酶的活性。β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性在37℃時最好，24hβ-葡萄糖苷酶的活性為95%。溫度到50攝氏度℃是β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性最高，且24小時內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性為90%。溫度為65時℃β-葡糖苷酶的穩(wěn)定性較差，β-葡糖苷酶的全活性在6小時內(nèi)降至0。

1.6.4 β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性

在不同pH條件下于50℃保溫2h后，測定β-糖苷酶的相對酶活性。在50℃加熱2h后，β-糖苷酶在pH 4.0至6.0具有良好的穩(wěn)定性，酶活性為大于85%。在pH 8.0的條件下，在50℃下保溫2小時后，酶活性僅為原始酶的50%。

2討論

β-葡萄糖苷酶也稱為葡糖苷酶水解酶，也稱為龍膽二糖酶，長纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它屬于蛋白水解酶的類別。來自相同來源的芥子油苷酶的分子量和范圍從數(shù)十kDa到數(shù)百kDa。葡糖苷酶最早是在1837年由Liebig和Wohler在苦腰果中發(fā)現(xiàn)的。作為纖維酶的組成部分，芥子油苷的主要基本功能是使非真實的還原性糖苷鍵與糖鏈末端復(fù)合，并根據(jù)實際情況釋放葡萄糖和配體。另外，β-葡萄糖苷酶可以弱化對硝基苯半乳糖不耐受性和脫氫肋骨內(nèi)酯，這在生產(chǎn)實踐中起著重要作用[4]。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系統(tǒng)中最重要的酶。當乙酸纖維蛋白酶富含纖維素時，它的重復(fù)使用和葡萄糖苷酶的缺乏將導(dǎo)致大量纖維素二糖積聚。乳糖的大量積累實際上將對酶促反應(yīng)形成非常強的即時反饋抑制作用。纖維素酶水解并顯著增強果膠酶。系統(tǒng)中葡萄糖苷酶的活性對于提高果膠水解產(chǎn)物的速度和效率以及增加葡萄糖的年產(chǎn)量最為重要。因此，對葡萄糖苷酶的研究仍具有重要的理論和實用性。

黑曲霉tj02氯酸鹽的多種化學誘變方法導(dǎo)致了β-葡萄糖苷酶突變體des-7，并具有較高的穩(wěn)定性。與原始菌株相比，des-7的酶生產(chǎn)能力大大提高了至少30%。在工業(yè)部門，菌株的生產(chǎn)能力是關(guān)鍵點之一，而因素也與產(chǎn)品生產(chǎn)的成本直接相關(guān)。分子遺傳學技術(shù)的整體發(fā)展取決于基因工程技術(shù)。分離株轉(zhuǎn)化的非凡成就取得了重大突破。因此，基因工程僅限于具有詳細遺傳基團信息和清晰代謝功能和途徑的菌株，而遺傳背景不明確的菌株是沒有辦法進行定向改造。相反，傳統(tǒng)的誘變育種方法如紫外線誘變育種、理化誘變育種等，不需要受到遺傳遺傳學經(jīng)濟背景的限制。對硫酸二乙酯進行了化學和物理誘變育種，獲得了持續(xù)高產(chǎn)的芽孢桿菌，這直接證明了傳統(tǒng)的化學誘變方法更有效。菌株轉(zhuǎn)化是利用單一重要因子實驗結(jié)果對突變株DES-7的碳源和氮源進行充分優(yōu)化的方法。當?shù)礊樘鹩衩仔荆礊榻湍阜酆吐然@時，β-葡萄糖苷酶活性為39IU/mL，比初始菌株提高了85.7%。確定了β-葡萄糖苷酶的最佳室內(nèi)溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。證明了β-糖苷酶在55℃和pH 5.0時酶活性最高，在37℃和50℃下保持良好的高可控性，在pH 4.0～6.0時穩(wěn)定性較好。木質(zhì)膳食纖維的蛋白質(zhì)水解一般在50℃下進行，本研究獲得的突變菌株半乳糖在50℃下能保持較高的穩(wěn)定性，可加入到膳食纖維酶系中用于木質(zhì)粗纖維的水解[5]。

3結(jié)語

β-葡萄糖苷酶已在我國許多行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。它具有巨大的商業(yè)形式，潛力無限。發(fā)酵總體水平低一直是β-葡萄糖苷酶工業(yè)化為能生產(chǎn)的主要原因。當前對于提高β-葡萄糖苷酶對天然發(fā)酵過程進行了整體優(yōu)化，并對菌株進行了改良。

參考文獻：

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[2]周紅，張陽，宋育陽，et al. 不同啟動子及錨定蛋白對釀酒酵母表面展示β-葡萄糖苷酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2020（10）.

[3]羅秀針，鄭金華，林燕燕，等. 1株灰黃霉素產(chǎn)生菌的誘變選育及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 福建農(nóng)業(yè)科技，2020（6）：12-16.

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[5]喻帆，方佳雙，應(yīng)靈萍，等. 細菌葉綠素a高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 中國抗生素雜志，2020（6）：567-572.