中性粒細胞彈性蛋白酶基因敲除改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠庫普弗細胞活化的研究

梁冰田 吳正琴 楊傳玉 杜衛東

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的一個進行性亞型，其特征是伴或不伴有纖維化的嚴重肝臟炎癥［1］。流行病學調查結果顯示，全世界約有25%的人口患有NAFLD，其中25%是NASH。這些NASH 患者與非NASH 患者比較，更容易進展為肝硬化或肝細胞癌（HCC）［2］。除此之外，NASH 患者還容易并發代謝紊亂，如肥胖、2 型糖尿病（T2DM）和高血壓（HTN）［3］。然而，由于NASH 的發病機制尚未完全闡明，目前尚無公認的治療NASH的藥物。NAFLD整個疾病進程（單純性脂肪肝-NASH-肝纖維化）中均可見肝小葉內中性粒細胞浸潤這一重要的病理學特征［4-5］。中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）是中性粒細胞分泌的最重要的活性蛋白酶之一，已被證明能改善飲食誘導的小鼠肥胖和胰島素抵抗，NE-/- 肥胖小鼠脂肪組織中性粒細胞以及巨噬細胞的浸潤較肥胖小鼠明顯減少，相關炎癥減輕［6-7］。本研究旨在探討NE 在高脂飼料（HFHC）誘導的NASH 中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 ApoE-/-小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，NE-/-小鼠購自Jackson 實驗室。NE-/-ApoE-/-小鼠由ApoE-/-小鼠與NE-/-小鼠雜交F4 代以上獲得。實驗動物HFHC 均購自美國戴茨（Dyets，USA）公司，貨號：100244，配方為：20%蛋白質（17kcal）、50%碳水化合物（43kcal）、21%脂肪（40kcal）和1.5%膽固醇（0kcal）。對照飼料為低脂飼料（LFD），貨號LF10B，配方為：17%蛋白質（17kcal）、71%碳水化合物（73kcal）、4%脂肪（10kcal）和0%膽固醇（0kcal）。

1.2 動物選擇與分組 將購買來的ApoE-/-小鼠和NE-/-小鼠進行繁殖，選取8 周齡雄性NE-/-ApoE-/-小鼠和ApoE-/-小鼠，HFHC 長期喂養建立NASH 模型：HFHC-ApoE-/-和HFHC-NE-/-ApoE-/-組（n=8）。以LFD 長期喂養小鼠視為對照組：LFD-ApoE-/-和LFD-NE-/-ApoE-/-組（n=8）。喂養16 周后空腹過夜稱體重，常規處死采集血標本、稱量肝重，肝左葉固定部位取材制備肝臟石蠟切片和冰凍切片，其余按葉分裝于凍存管80℃保存留待其余實驗所需。

1.3 血清學指標檢測 采集隔夜禁食小鼠眼眶血，室溫靜置30min 后3000rpm 離心15min 取上清液。檢測谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。

1.4 基因鑒定 采用堿裂解法提取小鼠尾部組織DNA。具體步驟如下：在50mm NaOH 100μl 95 ℃下對小鼠尾部組織進行1h 裂解，隨后加入100μl pH8.0Tris HCL，12000r/min 4℃離心10min 取離心上清液和2*Taq PCR mastermix 構建小鼠DNA PCR 反應體系，在以下條件下對小鼠DNA 進行PCR 擴增：95℃5min 循環1 次；95℃ 30s 循環1 次；58℃ 30s 循環1 次；72 ℃ 45s 循 環35 次；72 ℃ 5min 循 環1 次，保溫10℃。以蒸餾水稀釋10 倍而成的0.5×TBE 緩沖液為流動緩沖液，在GeneGreen 核酸染料染色后的2%瓊脂糖凝膠上電泳（200V30min）分離PCR 產物，紫外光下觀察。相關鑒定引物序列詳見表1。

表1 基因鑒定引物序列

1.5 肝臟組織病理 肝臟組織經通用型組織固定液固定48h 后流水沖洗30min，梯度酒精脫水（75%酒精1h，95%酒精1h×2 次，100%酒精30min×2 次），二甲苯透明（二甲苯酒精20min，二甲苯15min×2 次），65℃石蠟浸泡2h，石蠟包埋后常溫保存。切片后將石蠟切片放入65℃烤箱0.5h，之后依次放入二甲苯溶液中10min，100% 乙 醇10min，95% 乙 醇10min，75%乙醇10min，蒸餾水5min），加入足量蘇木素染色液5～10min，流水沖洗60s，滴入1%鹽酸乙醇3s 后快速水洗10s，伊紅染色液染色2min，水洗10s。脫水透明（依次放入75%乙醇5min，95%乙醇5min，100%乙醇10min×2 次，二甲苯溶液5min×2 次），中性樹膠封片。由專業病理科醫生參照美國國立衛生研究院NASH 臨床研究網絡病理工作組評分系統進行NAFLD 活動度評分（NAFLD activity score，NAS）［8］。油紅O 染色：采用新鮮現配油紅O 染色液（6 ∶4 配置）對組織切片進行染色。取10μm 厚度新鮮肝臟冰凍切片，10%多聚甲醛固定40min，PBS 清洗10min×3 次，再經60%異丙醇漂洗30s。油紅O 染色液染色15～20min，再經60%異丙醇漂洗10s×3 次，蒸餾水清洗10s，蘇木素復染核5min，流水沖洗10s，甘油明膠封片，光鏡下觀察拍照。

1.6 熒光定量RT-PCR 取肝臟組織約30mg，采用TRIZOL/氯仿抽提法提取總RNA。取2μg RNA 按照羅氏逆轉錄試劑盒cDNA 第一鏈合成系統逆轉錄合成cDNA，以20μl 反應體系加入2μl cDNA 模板，2μl引物，6μl 水，10μl SYBR Green mix 進行PCR 擴增，反應條件為：95℃ 10min，95℃15s，60℃1min40 個循環，GAPDH 作為內參，以2-ΔΔCT計算mRNA 表達相對水平。相關引物序列詳見表2。

表2 RT- PCR引物序列

1.7 免疫組織化學染色 石蠟切片后，脫蠟與水化依次進行二甲苯10min×3 次，100%酒精10min×2 次，90%、80%及70%酒精各10min，流水水洗10min，PBS 緩沖溶液沖洗5min×3 次，再對組織進行檸檬酸鹽-高壓（120℃）修復組織抗原10min。用3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶30min，PBS 與蒸餾水充分洗滌各10min×3次，10% BSA封閉1h，一抗4℃孵育過夜，滴加一抗反應增強液后二抗孵育1h，最終行DAB 顯色，顯微鏡下觀察并計數陽性灶，蘇木素復染核10min，流水返藍10min，鏡下拍照。

1.8 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，以雙側P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠基因分型結果 NE-/-ApoE-/- 小鼠由ApoE-/-小鼠與NE-/-小鼠雜交F4 代以上獲得。圖1為雜交后代所有基因分型結果，不斷繁殖直至擁有足夠實驗所需NE-/-ApoE-/-小鼠數量。

圖1 小鼠基因分型結果

2.2 體重、肝指數及血清學指標 ApoE-/-小鼠經HFHC 飲食誘導16 周后，體重、肝指數、AST、ALT、TC 和TG 水 平 明 顯 高 于LFD-ApoE-/- 小 鼠（P 均＜0.05）。NE 基因敲除則能夠明顯降低小鼠體重及上述指標（P 均＜0.05）。各組小鼠體質量及各項血清生物化學指標見表3。

表3 各組小鼠體質量及各項血清生物化學指標

2.3 肝臟病理 HE 染色結果顯示HFHC-ApoE-/-小鼠有嚴重的脂肪變性和多發性炎癥灶，較HFHCNE-/-ApoE-/-小鼠脂肪變性及炎癥反應則明顯減輕（P＜0.05）。油紅O 染色也顯示HFHC-NE-/-ApoE-/-小鼠肝脂肪變性的嚴重程度比HFHC-NE-/-ApoE-/-小 鼠 輕（P＜0.05）。 在 定 量 分 析 中，HFHC-NE-/-ApoE-/-小鼠病理評分：脂肪變性、小葉炎癥、NAS均低于HFHC-ApoE-/-小鼠（P＜0.05）（見圖2、3，表4）。

圖2 各組小鼠肝臟切片HE染色結果（×20）

圖3 各組小鼠肝臟切片油紅O染色結果（×20）

表4 各組小鼠NAS積分

2.4 肝臟內炎癥因子表達水平 在肝臟炎癥方面，通過IHC 染色（見圖4、5），發現HFHC-ApoE-/-小鼠肝臟中促炎性KC 標記物CD68 和F480 的表達明顯高于其余三組（P＜0.05）。LFD 飲食小鼠kupffer 細胞無明顯活化，而在HFHC 飲食小鼠中HFHC-ApoE-/-小鼠kupffer 細胞明顯活化，相對的HFHC-NE-/-ApoE-/-小鼠kupffer 細胞則活化水平明顯降低（P＜0.05）。熒光定量RT-PCR 結果顯示，與LFD-ApoE-/-小鼠比較，HFHC-ApoE-/-小鼠肝臟炎性細胞因子mRNA：CD68（P＜0.05）、F4/80（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05）和MCP-1（P＜0.05）的表達升高（P＜0.05），而NE 基因敲除下調了HFHC-ApoE-/-小鼠這些炎癥細胞因子mRNA 的表達（見圖6）。

圖4 各組小鼠CD68免疫組織化學結果（×40）

圖5 各組小鼠F4/80免疫組織化學結果（×40）

圖6 各組小鼠CD68，F4/80，MCP-1和TNF-α mRNA表達水平

3 討論

ApoE-/-小鼠之前被廣泛應用于動脈粥樣硬化模型的建立。近些年有研究發現西方飲食（WD）的ApoE-/-小鼠表現出異常的葡萄糖耐量、肝腫大、體重增加和NASH 的全譜，包括肝脂肪變性、纖維化和炎癥，但是無腎臟損害的跡象。WD 喂養的ApoE-/-小鼠代表了一種新穎、快速的模型，具有NASH 和MS（代謝綜合征）的所有特征，非常適合NASH 研究［9］。

NE 由中性粒細胞分泌，在生理條件下，NE 能夠協助清除病原體，促進吞噬細胞消除有害病菌，有助于組織的愈合和再生，但NE 的過量表達則會對機體組織基質造成危害，表現為破壞血管壁成分，進一步趨化中性粒細胞及釋放IL-8、TNF-α 等炎癥因子導致炎癥加重，NE 的促炎作用已在多種疾病模型中得到證實［10］。最新研究結果表明，中性粒細胞分泌NE 可能是介導系統性低度慢性炎癥和胰島素抵抗的主要機制，NE 處理肝細胞會引起細胞胰島素抵抗，NE-/-的肥胖小鼠脂肪組織中性粒細胞以及巨噬細胞的浸潤較肥胖小鼠明顯減少，同時糖耐量水平和胰島素敏感性明顯改善［7］。

本研究利用NE 與ApoE 基因敲除小鼠，采用可以顯示人類NASH 大部分特征的HFHC 飲食ApoE -/-小鼠模型。造模16 周時，小鼠大體及生化學指標均出現了NASH 的特征性變化，肝臟染色顯示脂肪變性和炎癥細胞浸潤，熒光定量RT-PCR 及免疫組化顯示相關炎癥因子的表達增高。NE 基因敲除對HFHC 誘導的ApoE-/-小鼠肥胖、脂肪變性和肝臟炎癥均具有保護作用。

庫普弗細胞（KC）募集和活化在NAFLD 炎癥的發生和發展中起著重要的作用，激活的KC 可分泌炎癥因子如TNF-α、白細胞介素1、白細胞介素10 等，募集炎癥細胞并放大肝臟炎癥參與機體慢性炎癥狀態的形成［11-12］。本研究以CD68 和F4/80 作為KC 細胞活化標志，發現NE 基因敲除能明顯減少KC 細胞的活化，表明NE 促進KC 細胞活化是其影響NASH 炎癥反應的重要機制。

綜上所述，本研究表明NE 基因敲除能改善HFHC 誘導的ApoE -/-小鼠NASH，其作用機制可能是敲除NE 基因，消除NE 介導炎癥、胰島素抵抗和激活KC 細胞的作用，從而起到改善NASH 的作用。