吡西達替尼抑制NLRP3通路保護腦缺血后神經功能的恢復

杜小雪 鄒陽 方馬榮

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）是臨床上常見的神經系統疾病之一，可引起腦內膠質細胞免疫應答和急劇的炎癥反應。小膠質細胞是卒中后炎癥反應最主要的細胞來源。NLRP3 是NOD 樣炎癥小體，在腦內參與調控小膠質細胞集落因子1 受體（CSF1R）介導的下游炎癥反應，并催化促炎因子釋放，加重神經損傷［1］。因此尋找抑制NLRP3 的抗炎藥物對緩解腦缺血患者體內炎癥和神經損傷具有重要作用。吡西達替尼（Pexidartinib）是一種新型口服小分子酪氨酸激酶抑制劑，對CSF1R 具有較強的選擇抑制性。被報道作為臨床抗癌前期實驗藥物用于腱鞘巨細胞腫瘤的Ⅰ期、Ⅲ期治療等［2］。本研究主要從NLRP3 信號通路探究吡西達替尼對腦缺血小鼠抗炎機制的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性C57/B6J 小鼠50 只，體質量25～30g，清潔級，8 周齡。所有小鼠購自中科院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司，小鼠的飼養與實驗操作均于浙江大學動物實驗中心完成。

1.2 藥物 實驗用藥品吡西達替尼Pexidartinib，又稱PLX-3397，購自MCE 公司，目錄號為HY-16749，并溶解于DMSO 溶液中至10mg/ml 備用。

1.3 試劑和儀器 抗Iba1 抗體購自Abcam 公司（兔抗，批號ab178847）；抗NLRP3 抗體購自Abcam 公司（兔抗，批號ab214185）；抗Caspase1 抗體購自Abcam公司（兔抗，批號ab179515）；抗NF-κB 抗體購自Abcam 公司（兔抗，批號ab16502）；超敏酶標羊抗兔抗體來自于北京中杉生物公司（批號107257D9）；熒光羊抗兔抗體來自武漢博士德公司（批號BA1142）；RNA 提取試劑盒購自TaKaRa 公司（批號AK1401）；SYBR PremixEx TaqTMII 購 自TaKaRa 公 司（ 批 號AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix 購 自TaKaRa公司（批號AK5101）。冰凍切片機來自德國LAIKA 公司；Olympus BX53 手動正置熒光顯微鏡來自Olympus公司；Bio-Rad 化學發光成像儀來自杭州寶誠生物技術有限公司；吸入麻醉機來自深圳瑞沃德公司。

1.4 實驗方法 （1）動物分組。實驗動物分組，將大鼠隨機分為5 組，每組各10 只：①正常組；②假手術組；③DMSO 組；④腦缺血組；⑤吡西達替尼組。（2）造模。小鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型參照Coll 等［3］的方法建立。具體操作過程如下：小鼠稱重，腹腔注射5%戊巴比妥鈉（5ml/kg）麻醉。仰臥固定后，頸部正中縱切口，分離并暴露右側頸總動脈（CCA），頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）。結扎CCA 近心端和ECA 基底部，CCA 處剪口，用直徑為0.3mm 的線栓插入右CCA 管腔，并緩慢前進至ICA 遠端直至不能推進為止，約7mm。缺血90min 后緩慢將線栓拉出并結扎CCA 遠端，形成再灌注損傷。縫合切口，術畢。放回籠內，單籠飼養。小鼠蘇醒后左上肢屈曲、行走時左側旋轉或左側肢體癱瘓的小鼠為堵塞成功。假手術組大鼠只分離、暴露血管，不結扎CCA 及ECA，不插入線栓。吡西達替尼組，術后連續給予吡西達替尼腹腔注射（1mg/kg）7d。DMSO 組小鼠腹腔注射與吡西達替尼組等體積的DMSO 溶劑。

1.5 神經癥狀評分 參照Longa 的方法進行評分。評分標準：0 分為無明顯神經功能缺損癥狀；1 分為不能完全伸展左側前爪；2 分為向左側旋轉；3 分為行走時向左側傾倒；4 分為不能自行行走，意識障礙。采用雙盲方式對小鼠術后行為進行評估。

1.6 標本和檢測指標 麻醉所有小鼠，將每組3 只小鼠的大腦進行冰凍切片包埋。對冰凍標本進行Iba1免疫熒光檢測，觀察腦缺血后大腦皮層中Iba1 表達的改變。每組4 只小鼠大腦皮層組織用于實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（QPCR）檢測（TaKaRa 公司RNA 提取試劑說明書，提取組織中的總RNA 進行逆轉錄，并測定mRNA 的表達量），觀察小膠質細胞相關炎癥因子TNF-α、IL-10、Arg1 和iNOS 的表達。引物序列見表1。剩下每組3 只小鼠大腦皮層組織用于Western Blot，觀察NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 的蛋白表達變化。

表1 TNF-α、IL-10、Arg1、iNOS和β-Actin的引物序列

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，對于屬于正態分布的五組數據應用單因素方差分析比較，并進行兩兩比較的q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吡西達替尼緩解腦缺血小鼠神經功能損傷 神經癥狀評分能夠評估各組小鼠的神經行為功能情況。評分越高，神經損傷越嚴重。對照組和假手術組神經功能評分為0，說明這兩組小鼠無損傷；腦缺血組和DMSO 組小鼠神經功能損傷顯著，分別為（3.33±0.51）分和（3.16±0.75）分，與正常組比較，P＜0.001；吡西達替尼組神經功能損傷明顯減輕為（1.83±0.75）分，與腦缺血組和DMSO 組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 吡西達替尼減少腦缺血再灌注小鼠大腦皮層Iba1的表達 免疫熒光檢測小膠質細胞標志蛋白Iba1 在吡西達替尼治療前后的表達變化（見圖1）。統計結果顯示，與假手術組和對照組比較，腦缺血組和DMSO 組的Iba1 表達顯著增加（P＜0.001）。相對于腦缺血組，吡西達替尼組的Iba1 表達降低（P＜0.01）（見表2）。結果表明，吡西達替尼能夠有效地抑制小膠質細胞標志蛋白Iba1 的表達。

表2 各組小鼠大腦皮層Iba1表達比較（±s）

表2 各組小鼠大腦皮層Iba1表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.001；與腦缺血組比較，#P＜0.01

組別 正常組 假手術組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達替尼組Iba1 表達 1.01±0.41 1.10±0.30 2.70±0.14* 2.40±0.17 2.10±0.23#

2.3 吡西達替尼治療能夠抑制腦缺血后小膠質細胞相關炎癥因子的表達 通過QRT-PCR 法觀察腦缺血后小鼠大腦皮層小膠質細胞相關炎癥TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 的表達變化。結果表明，與對照組比較， 腦 缺 血 組TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因 子的mRNA 表達顯 著 增 加（P＜0.01、P＜0.001）。相 對于腦缺血組，吡西達替尼組TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因子的mRNA 表達顯著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）（見表3）。結果表明，吡西達替尼通過抑制小膠質細胞相關因子TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1的表達而發揮保護神經細胞的作用。

表3 各組小鼠大腦損傷部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表達比較（±s）

表3 各組小鼠大腦損傷部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01，#P＜0.001；與腦缺血組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01，△△P＜0.001。TNF-α：腫瘤壞死因子α；iNOS：誘導型一氧化氮合酶；IL-10：白介素10；Arg-1：精氨酸酶1

組別 正常組 假手術組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達替尼組TNF-α 4.29±1.14 4.83±0.64 9.49±0.45# 10.21±1.14 7.04±0.50 △△iNOS 2.62±0.94 2.50±0.45 6.49±0.45# 6.88±0.41 4.70±0.77 △IL-10 1.23±0.21 1.17±0.16 2.43±0.11* 2.40±0.10 1.91±0.06 ▲Arg-1 1.80±0.17 1.89±0.25 3.43±0.10* 3.40±0.12 2.01±0.02 △△

2.4 吡西達替尼抑制腦缺血組NLRP3 信號通路 Western Blot 結果顯示，在假手術組和對照組小鼠中，NLRP3、NF-κB 和Caspase1 低表達。腦缺血組和DMSO 組NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與腦缺血組和DMSO組比較，吡西達替尼組NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表達顯著降低（P＜0.01、P＜0.001）（見圖2、表4）。

圖2 各組NLRP3，NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達圖

表4 各組小鼠大腦皮層NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達比較（±s）

表4 各組小鼠大腦皮層NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.001；與腦缺血組比較，#P＜0.01，▲P＜0.001。NLRP3：NOD樣受體蛋白3；NF-κB：核因子κB蛋白；Active-Capase1：活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1

組別 正常組 假手術組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達替尼組NLRP3 0.51±0.05 0.60±0.10 1.30±0.10* 1.47±0.03 0.87±0.07 ▲NF-κB 0.71±0.05 0.65±0.05 1.13±0.07* 1.13±0.03 0.74±0.09#Active-Capase1 0.38±0.06 0.40±0.04 0.52±0.08* 0.59±0.05 0.36±0.06 ▲

3 討論

吡西達替尼是集落刺激因子1 受體（CSF1R）的特異性抑制劑，通過抑制CSF1R 的磷酸化，對小膠質細胞的活性有重要作用。2014 年，吡西達替尼被美國食品和藥物管理局（FDA）授予用于治療色素沉著的絨毛結節性滑膜炎（PVNS）和腱鞘巨細胞腫瘤的臨床研究［4］。本次研究首次在基礎研究中證實吡西達替尼能顯著抑制NLRP3 炎癥通路，在腦缺血再灌注小鼠中實現神經保護作用。

膠質細胞免疫治療是治療腦卒中的新趨勢。腦卒中發生后，機體自身的免疫系統會被激活進而通過免疫細胞如小膠質細胞、星形膠質細胞等的調節作用抵御損傷部位氧糖缺失［5］。同時炎癥反應促使機體釋放大量的TNF-α 和iNOS［6］。TNF-α 的過度表達會加重腦損傷。iNOS 表達的上調，使一氧化氮（NO）合成分泌增加，促進小膠質細胞向損傷部位聚集，進一步加重腦的損傷［7］。CSF1R 表達聚集，促進小膠質細胞形態轉變，釋放IL-10 和Arg1 因子，不利于患者預后。在本研究中，小鼠局灶性腦缺血損傷誘導TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達顯著增加，小膠質細胞聚集，催化Iba1 表達增加和IL-10 和Arg1 釋放。而吡西達替尼能夠有效降低小膠質細胞Iba1 表達，并抑制TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達以及IL-10 和Arg1 釋放，抑制局部炎癥。

小膠質細胞依賴的CSF1R 炎癥激活在神經免疫中起重要作用，尤其是NLRP3 炎性小體介導炎癥反應［3］。NLRP3 是NOD 樣受體3，能被機體各種內外源性危險信號激活后，通過活化半胱天冬酶-1（Caspase-1）進而促進 IL-1β、IL-18 的成熟和釋放，引起機體的炎癥反應［8］。既往的多項研究均發現，NLRP3 的激活能夠增加促炎基因，包括NF-κB、iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 的 表 達［9］。本 研 究結果顯示，吡西達替尼能夠顯著減少iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 在腦缺血組織的mRNA 表達，同時抑制NLRP3 炎癥信號相關蛋白NF-κB、活化的Caspase1蛋白的表達，具有較強的抗炎和神經保護作用。

綜上所述，吡西達替尼顯著降低小膠質細胞相關炎癥因子的mRNA 表達，抑制NLRP3 炎癥信號通路的激活，進而減少局灶性腦缺血后的小膠質細胞Iba1的表達，降低神經功能評分，促進腦缺血小鼠神經功能恢復，進而實現神經保護作用。