貝伐珠單抗在晚期非鱗非小細胞肺癌治療中的相關血漿生物標志物研究

丁玲玉 江哲龍 莫麗欽 張珍 吳海鷹 潘月龍

血管內皮生長因子A（VEGF-A），貝伐珠單抗，在多種腫瘤中顯示了較好的療效［1］。不同的患者從貝伐珠單抗治療獲益與否以及獲益的程度均不一樣，目前有急切的需求來篩選出最有可能獲益的患者。至今均未確定一個在臨床中能應用的有預測療效的標志物。未經選擇的非鱗非小細胞肺癌患者，一線化療或后線化療的基礎上聯合貝伐珠單抗顯示了更好的療效和更長的生存時間［2-3］。在非小細胞肺癌開展過一些標志物的研究，包括VEGF 配體和受體（VEGFRs）、成纖維生長因子（FGF）等［4-5］。關于血漿標志物的預測作用不同的研究數據大不相同。雖然貝伐珠單抗阻斷了VEGF 通路，但血管生成的錯綜復雜常導致了耐藥的產生。動物模型顯示腫瘤細胞或間質細胞表達的粒細胞集落刺激因子（G-CSF）是抗VEGF 治療耐藥的一個決定因素［6］。本研究旨在探索在非小細胞肺癌中，血漿標志物和貝伐單抗聯合化療有效率（ORR）之間的關系。主要研究終點為ORR 和基線VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 水平的相關性。次要研究終點包括無疾病進展時間（PFS）和基線血漿標志物相關性，血漿標志物的動態變化。

1 材料與方法

1.1 研究設計 該研究是在中山大學附屬腫瘤醫院進行的一個單臂II 期臨床研究。入組標準：轉移性非鱗非小細胞肺癌患者；年齡＞18 歲；美國東部腫瘤協作組（ECOG）體能狀態（PS）評分0～2 分；存在實體腫瘤療效評價標準（RECIST）1.1 版可評估的病灶；充足的血液、肝腎儲備功能。排除標準：組織學為鱗狀細胞癌；＞2 級咯血；不能有效控制的高血壓；有癥狀的中樞神經系統轉移。研究方案獲得了中山大學腫瘤醫院的倫理委員會審查、通過。該試驗嚴格遵從赫爾辛基宣言。所有患者均簽署了書面知情同意書。

1.2 研究方案 符合入組標準的患者進行每3 周靜脈注射7.5mg/kg 貝伐單抗，劑量參照AVAPERL 研究［2］。根據研究者決定，化療方案為每3 周靜脈注射500mg/m2培美曲賽或聯合75mg/m2順鉑。培美曲賽、順鉑聯合貝伐單抗最多給予6 周期，獲得緩解或穩定的患者繼續給予培美曲賽聯合貝伐單抗維持治療，直到疾病進展或不可耐受的副作用。

1.3 標志物樣本收集 在基線和2 周期治療后，用乙二胺四乙酸（EDTA）管采集5ml 患者外周血標本。采血30min 內予1000r/min 低溫離心15min。隨后，取上清液（血漿）儲存在-80℃冰箱，在分析前避免凍融。

1.4 標志物分析方法 選取VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 為該研究的候選血漿標志物。標本送到廣州金域檢驗中心進行檢測。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法，美國Quantikine 研發系統試劑盒進行檢測。

1.5 療效和安全性評價 在基線及每2 周期治療后進行高分辨CT 掃描評價腫瘤大小。采用RECIST 1.1 版緩解評估緩解率。采用國家癌癥研究所不良事件的通用術語標準（NCI-CTCAE）3.0 版進行安全性評價，在每周期治療后以及結束治療后每月進行毒性分級。

1.6 統計學分析 該研究主要研究終點為基線血漿VEGF-A，VEGFR-2 和G-CSF 與ORR 的關系。次要研究終點包括標志物與PFS 的關系，標志物水平動態變化。在做統計分析時，用樣本的中位濃度二分類為高水平（≥中位值）和低水平（＜中位值）組。然而，外周血中G-CSF 實際檢測水平較低，以標準曲線能檢測出最低水平為界，分為高水平（≥39ng/ml）和低水平（＜39ng/ml）組。血漿標志物對ORR 的預測價值采用SPSS 19 版logistic 回歸進行分析。Cox 比例風險模型則用來分析血漿標志物和PFS 之間的關系。2 周期治療后和基線標志物水平的動態變化采用配對樣本T檢驗進行分析。

2 結果

2.1 患者特征 自2016 年11 月至2017 年12 月入組了45 例患者，提供了基線血漿標本。37 例患者提供2周期治療后的血漿標本。截止2018 年3 月25 日數據凍結。19 例未經治患者予培美曲賽/順鉑聯合貝伐單抗治療；26 例經治患者予培美曲賽聯合貝伐單抗治療?；颊呋€特征見表1。

2.2 基線血漿標志物和ORR 的關系 研究發現基線低水平G-CSF 比高水平的患者有效率更高；基線高水平VEGF-A 比低水平的患者傾向于更高的有效率；VEGFR-2 的水平高低與有效率無顯著相關性（見表2）。

表1 基線特征

2.3 基線血漿標志物和PFS 的關系 三個基線血漿標志物均不能預測PFS 的長短。表3 總結了基線血漿標志物低水平和高水平組患者的PFS、HR 和P 值。

表3 基線血漿標志物和PFS的關系

2.4 血漿標志物的動態變化 患者在2 周期治療后的血漿VEGF-A 水平比基線有顯著升高（見表4）。

表4 血漿標志物動態變化

2.5 療效 41 例患者可評價有效率，有效率為31.7%，在一線治療亞組為35.3%，既往經治亞組為29.2%。ITT 人群的PFS為4.97個月（95%CI，3.38～6.56）。一線治療亞組PFS 為5.21 個月，既往經治亞組的PFS為4.63 個月。截止分析時，有6 例患者仍在接受方案治療，其中4 例患者給予培美曲塞單藥。

2.6 安全性 45 例患者全部納入安全分析。39 例患者（86.7%）經歷了＞1 級的不良反應（AE），最常見的AE 為1/2 級。最多見的血液學AE 是白細胞下降，有14 例患者（31.1%）發生了白細胞下降，其中5 例為3/4 級。最多見的非血液學AE 是疲勞，16 例患者（35.6%）發生了疲勞，其中4 例為3 級。作者也總結了貝伐單抗相關的AE。13 例患者（28.9%）發生了蛋白尿，其中1 例為3 級。10 例患者（22.2%）發生了高血壓，其中3 例為3/4 級。10 例患者（22.2%）發生了鼻出血，其中1 例為3 級。3 例患者因為毒副反應停用方案治療。該研究過程中未出現藥物相關的死亡。

3 討論

本研究探討晚期非鱗非小細胞肺癌患者中血漿標志物和腫瘤緩解率的相關性。研究發現血漿G-CSF 水平和貝伐單抗治療有效率有負相關，而血漿VEGF-A水平與貝伐單抗治療有效率有較強的相關趨勢。

具有更多的腫瘤病灶或者更晚期的腫瘤傾向于具有更高水平的循環VEGF-A，表明VEGF-A 水平可能反映了腫瘤負荷。多個研究已經證實了血漿VEGF-A在肺癌中的預后價值［7］。循環VEGF-A 水平越高可能預示腫瘤的血管生成越依賴VEGF 通路。在ECOG 4599 研究提示更高水平的VEGF-A 與更高的緩解率相關［4］。而ABIGAIL 研究則發現基線低水平VEGF-A和更長的PFS 和總生存相關，VEGF-A 高水平組患者有效率有更高的趨勢［5］。本研究則表明VEGF-A 高水平組患者傾向于更高的有效率和更長的PFS。血漿VEGF-A 對貝伐單抗療效的預測研究結果不一致，可能的原因在于：首先，不同實驗室方法和分析有不同的標準和敏感性；其次，核糖核酸的剪接方式不同，血漿中存在短亞型和長亞型，往往VEGF-A165 水平最高。采用新型酶聯免疫吸附試驗方法檢測，短亞型比長亞型需要更高的敏感性。最后，不同研究用了不同的抗凝劑處理血標本。早期的研究用的檸檬酸鈉抗凝劑，而近期的研究用的是EDTA 抗凝劑。

本研究未發現VEGFR-2 和療效的相關性。此結果與ECOG 4599 研究的標志物分析［4］以及ABIGAIL研究結果一致［5］。雖然VEGFR-2 在調節腫瘤血管生成中扮演了重要的角色［8］。本研究發現在2 周期貝伐單抗治療后血漿VEGF-A 和VEGFR-2 均有一定程度的升高。循環中游離的VEGF-A 會與貝伐單抗結合，難以鑒別游離或結合的VEGF-A。

腫瘤的血管生成是一個錯綜復雜的信號網絡。而G-CSF 在調動血液干細胞、前體細胞以及成熟細胞釋放入外周血循環來刺激腫瘤的血管生成中扮演了重要的角色［9］。G-CSF 是耐藥相關的旁分泌信號網絡中的一員，通過核因子κB 和細胞外信號調節激酶信號來促進耐藥的產生［6］。動物模型表明耐藥腫瘤表達了更高水平的G-CSF。本研究首次在臨床上分析了血漿G-CSF 在抗血管生成治療中的作用。然而本研究發現部分患者的血漿G-CSF 水平太低以至于檢測不到。本研究發現血漿G-CSF 低水平的患者相比水平高的患者具有更高的緩解率。說明G-CSF 可能是抗VEGF 治療耐藥的一個決定因素。但未發現G-CSF 水平與PFS 相關，可能因為研究入組了初治和經治患者，導致了時間終點的復雜性。

總之，腫瘤血管生成的復雜性和方法學的不確定性，導致難以確立預測貝伐單抗療效的標志物。本研究結果與既往研究類似，未發現VEGF-A 和VEGFR-2的預測價值。本研究新穎之處在于從耐藥入手，創新性檢測了G-CSF，分析了G-CSF 和療效的相關性，初步結果表明G-CSF 能一定程度上預測貝伐單抗耐藥，為進一步探討預測貝伐單抗耐藥性生物標志物提供了初步基礎和研究方向。