黃金抹茶堿液浸泡蒸青護綠工藝優化及品質研究

魯 穎譚永生姚茂君楊 茜孫 雯

(1. 吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2. 吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000；3. 湘西自治州質量檢驗及計量檢定中心，湖南 吉首 416000)

黃金茶是湘西特有的珍稀地方茶樹品種資源[1]，其氨基酸含量和水浸出物含量分別為7.47%，41.04%，高出同期其他綠茶，而茶多酚含量僅為18.04%[2]，高浸出物和低酚氨比的優異特性使得黃金茶成為生產抹茶的優質原料[3]。色澤是評判抹茶品質等級的重要因素，翠綠的色澤是高品質抹茶所必須具備的[4-5]。但在抹茶加工過程中，葉綠素易受光、熱、pH等外界因素的影響而發生褪色或變色[6]，顯著影響抹茶品質。

目前，國內外學者對果蔬護綠進行了大量研究，而對茶葉的護綠工藝卻鮮見報道。果蔬加工中常將物理漂燙作為控制酶促褐變的預處理方法，以保證產品具備良好的色澤和感觀[7-9]。而抹茶通常使用物理蒸青來鈍化酶的活性，其主要是利用蒸汽穿透葉層，使葉溫迅速升高，從而達到加速葉中酶鈍化的效果，最大程度地減少葉綠素等內含成分的損失[10-11]。常用的化學護綠方法主要有堿液浸泡、各類護綠劑(如抗壞血酸、金屬離子化合物、葉綠素銅鈉鹽等)處理等[12-14]。銅、鋅等金屬離子處理方法受元素殘留等食品安全性問題的影響，使用受到限制[15]；葉綠素銅鈉鹽等護綠劑染色法成本較高，在實際應用中較少使用[16]。而堿液處理可使葉綠素發生水解皂化反應，生成綠色葉綠素鈉鹽[17]，且能除去黃金茶表面的蠟膜利于護綠劑的滲透，達到良好的護綠效果[18]。該方法護綠效果明顯、操作簡單易行、無食品安全性問題，因此被廣泛應用于果蔬的護綠工藝中。研究擬以黃金茶為原料，結合蒸汽殺青和堿液浸泡的護綠方式研制色澤翠綠的高品質黃金抹茶。利用Plackett-Burman(PB)試驗篩選出顯著因素[19]，通過最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗確定最佳護綠工藝，并對黃金抹茶進行品質研究，以期為黃金茶開發和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃金茶葉：湘西匯豐農業有限公司；

無水乙醇、丙酮：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

碳酸鈣、無水碳酸氫鈉：分析純，麥克林試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見—分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

電子天平：FA224型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

鼓風干燥箱：GZX-9246MBE型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

高速中藥粉碎機：ZN-400A型，上海元析儀器有限公司；

行星式球磨機：KQM-X4型，咸陽金宏通用機械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 堿液浸泡蒸青護綠法制備黃金抹茶 統一人工采摘經過遮陰覆蓋的一芽兩葉黃金茶，選擇大小均一，色澤均勻，成熟度一致，無傷、無病蟲害的茶葉，經無水碳酸氫鈉溶液浸泡后迅速用流動水沖洗，備用。放入蒸汽器具隔板中進行蒸青處理，保持蒸青器具溫度和鍋內壓力一致，以控制所有批次的蒸汽量一致。蒸青后取出，置于鼓風干燥箱中烘干(80 ℃)，直至恒重。最后將烘干后的茶葉置于高速中藥粉碎機進行粗粉碎，再用行星式球磨機進行超微粉碎。

1.2.2 黃金抹茶堿液浸泡蒸青護綠的工藝優化

(1) Plackett-Burman試驗：利用Plackett-Burman試驗考察堿液質量百分濃度、料液比、蒸青葉層厚度、堿液浸泡時間、蒸青時間5個因素對黃金抹茶葉綠素含量的影響，篩選出具有顯著影響的關鍵因素。每個因素取高(+1)、低(-1) 2個水平。

(2) 最陡爬坡試驗：根據Plackett-Burman試驗得到的一次擬合方程，設計各關鍵因素爬坡方向和步長，使得具有顯著影響的關鍵因素取值逼近最大響應區域，確定各重要因素最佳中心點[20]。

(3) 響應面優化試驗：根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗的結果，對篩選出的顯著性關鍵因素進行響應面(Box-Behnken)設計，對試驗結果建立自變量數學模型，并根據回歸方程繪制響應曲面圖和等高線圖。

1.2.3 不同加工方式對比 采用同一批鮮葉原料，經3種不同加工處理后，比較得到的黃金抹茶葉綠素、茶多酚、茶氨酸、酚氨比、水浸出物含量及感觀評價。

(1) 傳統蒸青(方式A)：參照1.2.1的方法，但不對采摘后的黃金茶鮮葉進行堿液浸泡和護綠劑處理，直接采用蒸汽殺青，干燥后超微粉碎得到黃金抹茶。

(2) 滾筒殺青(方式B)：設置殺青溫度145 ℃，時間2.5 min，將殺青葉干燥粉碎得到黃金抹茶。

(3) 堿液浸泡蒸青(方式C)：用經響應面優化后得到的最優工藝制備黃金抹茶。

1.2.4 指標測定

(1) 葉綠素含量：參照肖潤林等[21]的方法，稍作修改。用V丙酮∶V無不乙醇∶V蒸餾水=4.5∶4.5∶1.0的丙酮—無水乙醇—蒸餾水混合液提取黃金抹茶葉綠素，分別在645 nm和663 nm 處測定吸光度值，按式(1)和式(2)計算葉綠素含量。

c=(12.70×A663 nm-2.69×A645 nm)+(22.90×A645 nm-4.68×A663 nm)，

(1)

(2)

式中：

A663 nm——提取液在663 nm處的吸光度值；

A645 nm——提取液在645 nm處的吸光度值；

ω——葉綠素含量，mg/g；

c——葉綠素濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

m——樣品鮮重，g。

(2) 茶多酚含量：參照GB/T 8313—2018，以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線(Y=0.074 8+0.009 2X，R2=0.998 4)，先準確吸取測試液各1.0 mL，再加入5.0 mL 的福林酚試劑，搖勻。待反應3～8 min后，加入4.0 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，加水定容至25 mL。室溫下放置60 min 后在765 nm條件下用分光光度計測定其吸光度，根據標準曲線方程計算茶多酚含量。

(3) 游離氨基酸含量：參照GB/T 8314—2013，以谷氨酸為標準品，繪制標準曲線(Y=-0.259 6+2.651X，R2=0.999 1)，在比色皿中分別吸取1.0 mL測試液、0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25 mL，在570 nm處測定吸光度，根據標準曲線方程計算游離氨基酸含量。

(4) 水浸出物含量：參照GB/T 8305—2013，將黃金抹茶沸水浴浸提后趁熱減壓過濾，用沸蒸餾水洗滌數次后將茶渣連同濾紙移入烘皿后立即干燥直至恒重，最后稱量計算結果。

(5) 感官評定：參照Ikeda等[22]和李東娜等[23]的方法，稱取3.0 g抹茶，用80 ℃水在白瓷審評碗中沖泡5 min，由10位有經驗的審評員采用密碼審評法，對茶樣的色澤、湯色、香氣和滋味進行感官評分，其中色澤評分、湯色評分、香氣評分、滋味評分分別占總分的30%，10%，30%，30%。

1.2.5 數據處理 所有試驗重復進行3次或3次以上，結果用平均值表示，運用Excel 2003、Origin 9.0以及Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計篩選關鍵因素

在預試驗的基礎上利用Plackett-Burman試驗設計考察堿液質量百分濃度、料液比、蒸青葉層厚度、堿液浸泡時間、蒸青時間5個因素對葉綠素含量的影響，并篩選出顯著影響因素，各因素的水平取值及試驗結果見表1和表2。

根據表2的結果對數據進行回歸分析，得到對黃金抹茶葉綠素含量影響的一次回歸方程：

Y=2.080+0.051X1+0.021X2-2.282×10-3X3+0.024X4-0.026X5。

(3)

表1 Plackett-Burman試驗因素及水平取值

表2 Plackett-Burman試驗結果

表3 Plackett-Burman試驗方差分析?

2.2 最陡爬坡試驗確定最佳中心點

根據3個顯著因素的系數設計爬坡方向和步長，其中堿液質量百分濃度、堿液浸泡時間為正效應，取其高水平；蒸青時間為負效應，取其低水平。表4為最陡爬坡試驗設計及結果。

表4結果表明黃金抹茶葉綠素含量在第3組達到最高，說明最優點存在于第3組附近。因此以堿液質量百分濃度為0.15%、浸泡時間20 min、蒸青時間90 s為響應面試驗中心點，進行響應面優化。

2.3 Box-Behnken響應面優化分析

以堿液質量百分濃度、堿液浸泡時間和蒸青時間為自變量，葉綠素含量為響應值進行響應面優化，護綠工藝響應面試驗因素水平設計見表5，結果見表6。

利用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸方程擬合和方差分析，得到自變量的二次項回歸程：

(4)

表4 最陡爬坡試驗設計及結果

表5 Box-Behnken試驗因素及水平取值

圖1(a)和(b)顯示蒸青時間為0水平時，隨著堿液質量百分濃度從0.10%增加到0.20%，堿液浸泡時間從75 s增加到105 s，葉綠素含量先上升后下降。圖1(c)和(d)顯示堿液浸泡時間為0水平時，葉綠素含量隨堿液質量百分濃度及浸泡時間的增加呈先增加后降低的趨勢。圖1(e)和(f)顯示葉綠素含量隨堿液浸泡時間和蒸青時間的增加也呈先增加后降低的趨勢。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對模型進行優化分析得出的最佳工藝為堿液質量百分濃度0.16%，堿液浸泡時間20.33 min，蒸青時間92 s。為了在實際操作中的便利性，將最佳工藝修正為堿液質量百分濃度0.15%，堿液浸泡時間20 min，蒸青時間92 s，蒸青葉層厚度1 cm，料液比(m黃金茶∶V堿液)為1∶20 (g/mL)。為驗證該方法的準確性，采用上述所得最佳工藝進行3次驗證實驗，葉綠素平均含量為2.25 mg/g，與理論預測值基本符合，說明該回歸方程能夠真實地反映各因素對黃金抹茶葉綠素含量的影響。

2.4 不同加工方式黃金抹茶品質比較

2.4.1 主要化學成分 如表8所示，與傳統蒸青和滾筒殺青相比，堿液浸泡蒸青黃金抹茶的葉綠素含量分別提高了25.78%，40.44%；與滾筒殺青相比，傳統蒸青和堿液浸泡蒸青黃金抹茶的茶多酚含量增加4.44%，7.10%，游離氨基酸含量增加11.91%，9.97%，而傳統蒸青與堿液浸泡蒸青之間無顯著差異；3種方式制備的黃金抹茶水浸出物含量存在顯著性差異。可能原因是，炒青時茶葉升溫較慢，破壞酶活性的時間較長，同時鮮葉與高溫筒壁接觸摩擦，使得葉綠素破壞量較多；蒸汽殺青過程中茶鮮葉在短時間內被高溫蒸汽穿透，迅速地破壞酶活使葉綠素保留下來。經堿液浸泡的抹茶葉綠素含量更高，堿性環境使得葉綠素在高溫的殺青過程中受到保護，保證抹茶翠綠的色澤。茶多酚和游離氨基酸是決定抹茶滋味的重要物質，酚氨比低的抹茶滋味更加鮮爽。由表8可知，傳統蒸青的黃金抹茶的酚氨比最高，堿液浸泡蒸青處理的其次，但與傳統蒸青的無顯著差異。綜上，蒸汽殺青相比于滾筒殺青能較大程度地保留抹茶主要內含物質，而堿液浸泡在蒸青的基礎上進一步減少了葉綠素的損失，保證了高品質抹茶翠綠的色澤，且不會對茶多酚、游離氨基酸等其他內含物造成不良影響。

表6 Box-Behnken響應面試驗結果

表7 回歸模型方差分析及結果?

圖1 兩因素間交互作用響應面及其等高線圖

2.4.2 感官品質 由表9可知：抹茶色澤差異較明顯，堿液浸泡蒸青抹茶外觀色澤翠綠明亮，傳統蒸青抹茶次之，而炒青抹茶整體色澤偏黃、欠明，與上述成分分析中葉綠素含量的變化相符合。蒸汽殺青的滋味較為醇和，而炒青的滋味平和略澀，還帶有高火和焦味。傳統蒸汽殺青所需時間短、受熱較為均勻且盡可能避免了茶葉與傳熱儀器的摩擦接觸，保證了抹茶較為純正的香味，堿液浸泡前處理對其影響不大，但與炒青相比差異明顯。

表8 黃金抹茶品質比較?

表9 黃金抹茶品質的感官評分結果

3 結論

試驗最終得到的堿液浸泡蒸青最佳護綠工藝為：堿液質量百分濃度0.15%，堿液浸泡時間20 min，蒸青時間92 s，蒸青葉層厚度1 cm，料液比(m黃金茶∶V堿液)1∶20 (g/mL)。堿液浸泡蒸青護綠工藝可顯著提高黃金抹茶葉綠素含量，與傳統蒸青和滾筒殺青所得黃金抹茶相比，葉綠素含量分別提高了25.78%，40.44%；且不會對蒸青過程中其他內含成分造成不良影響，感觀品質好。試驗從工藝優化角度對黃金抹茶護綠工藝進行了研究，但未能對研制過程中葉綠素降解機理及其他護綠作用機制進行深入探究，后續可對此進行研究并探討其作用機制。