耐藥MTB分離株對不同組合抗結核藥品體外藥物敏感性試驗的結果分析

應若嫣 黃曉辰 王潔 劉一典 沙巍 楊華

結核病是由MTB引起的慢性傳染性疾病，療程長，易耐藥，嚴重危害人類的身體健康，是全球重大公共衛生問題。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[1]指出，復治患者分離菌株對4種一線抗結核藥品和11種二線抗結核藥品的任一耐藥率分別為35.9%和38.5%，可見復治結核病已成為耐藥結核病的主要來源，如果未積極治療極易發展成為耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)，甚至廣泛耐藥結核病(extensively drug-resisitant tuberculosis,XDR-TB)，遷延不愈[2]。為研究針對首次復治肺結核患者更快速更有效的治療方案[3]，同濟大學附屬上海市肺科醫院承擔了“十一五”“十二五”“十三五”傳染病重大專項——復治肺結核化學治療新方案的研究。經“十一五”研究驗證，推出了復治肺結核超短程治療方案[4]，將原標準方案(H-R-Z-E)中的利福平(R)、異煙肼(H)替換為含莫西沙星(Mfx)、對氨基水楊酸異煙肼(Pa)、利福布汀(Rfb)或利福噴丁(Rft)的2種新方案，即Mfx-Pa-Rfb-E-Z或Mfx-Pa-Rft-E-Z(其中E：乙胺丁醇；Z：吡嗪酰胺)，并在臨床開展應用。為了更準確地評估新方案的有效性，本研究選取入組“十二五”項目的首次復治肺結核患者分離培養的92株耐藥菌株為研究對象，優化了組合藥品藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測方法[5]，通過計算新方案對各菌株的抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)，對比分析標準方案和新方案體外組合藥品的抑菌效果，進一步評估優化抗結核新方案對首次復治肺結核患者的應用價值。

資料和方法

一、材料

1．菌株：搜集同濟大學附屬上海市肺科醫院“十二五”國家科技重大專項入組的148例首次復治肺結核患者，通過對患者痰標本進行BACTEC MGIT 960和改良羅氏法培養[包括H、R、E、Z、Pa、Mfx、Rfb、Rft]獲取167株MTB分離株，將75例患者經上述兩種方法進行藥敏試驗結果均為陽性的92株耐藥菌株(包括36株MDR-MTB、54株XDR-MTB和2株單耐H菌株)作為研究對象，并保存于-20 ℃甘油中。MTB標準株(H37Rv，編號：ATCC27294)購自國家菌種保存中心，作為實驗對照。本研究項目獲得醫院醫學倫理學委員會批準，批號：k19-008。

2．抗結核藥品：H、R、Pa、Rfb和Rft干粉均購自美國Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司，Mfx原粉購自美國MCE公司。藥品配置：所有藥品均稱量10 mg，Pa干粉用1 ml 4%NaOH配置成10 mg/ml，H干粉用1 ml 18.2 MΩ.cm的超純水配置成10 mg/ml，R、Rfb、Rft干粉用1 ml二甲基甲酰胺溶解配置成10 mg/ml，Mfx干粉用1 ml二甲基亞砜溶解配置成10 mg/ml，所有備用藥品溶液均用0.22 μm無菌濾器過濾除菌，分裝保存于-80 ℃下。

3．儀器與試劑：96孔無菌U形板購自浙江拱東醫療科技有限公司(原浙江拱東醫用塑料廠)，61010A-1型比濁儀、Middlebrook 7H9培養基干粉、營養添加劑(OADC)均購白美國BD公司。應用液為含10%營養添加劑的Middlebrook 7H9液體培養基，包被液為70%的18.2 MΩ.cm的超純水+30%無水乙醇+5%蔗糖。

二、研究方法

采用最低抑菌濃度(MIC)三維棋盤法[6]分別進行92株菌株和1株標準菌株(H37Rv)對H-R、Mfx-Pa、Mfx-Pa-Rfb、Mfx-Pa-Rft 4種藥品組合方案的體外藥敏試驗，分別以FICI≤0.5(2種藥品組合)或FICl≤0.75(3種藥品組合)作為是否具有協同作用的判斷界值，評估不同藥品的組合作用。

1.配置96孔板檢測濃度：92株菌株和1株標準菌株(H37Rv)，每株菌對應12塊96孔板，分別為H+R、Mfx+Pa、Mfx-Pa+Rfb(0.125 mg/L)、Mfx-Pa+Rfb(0.25 mg/L)、Mfx-Pa+Rfb(0.5 mg/L)、Mfx-Pa+Rfb(1 mg/L)、Mfx-Pa+Rfb(2 mg/L)、Mfx-Pa+Rft(1 mg/L)、Mfx-Pa+Rft(2 mg/L)、 Mfx-Pa+Rft(4 mg/L)、Mfx-Pa+Rft(8 mg/L)、Mfx-Pa+Rft(16 mg/L)藥敏試驗檢測板。依據文獻[4] 配置96孔板藥品組合(從上至下依次為A至H行，從左到右依次為1至12列，如表1所示)，并進行如下改動：

1)H-R組合及H、R單藥MIC濃度測定微孔板配置范圍：首先將A1孔和H12孔設為對照孔，各加入20 μl無藥培養基，再在第一行1～12和第一列A～H每孔各加入10 μl 電阻率為18.2 MΩ.cm的超純水，繼而沿96孔板Y軸從B行至H行每孔添加10 μl初始配置濃度為2.5、5、10、20、40、80、160 mg/L 的H(濃度由小到大)、沿96孔板X軸向2～12列每孔添加10 μl初始配置濃度為0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 mg/L的R(濃度由小到大)，則每孔混合后含液量均為20 μl，最終配置成含H的終濃度為1.25～80 mg/L和R的0.3～320 mg/L的單藥或兩藥混合的96孔板培養基。實驗前將每孔鋪滿20 μl含藥培養基的96孔U形板放在無菌超凈臺中風干后制成含藥干板待用。使每孔在加入200 μl菌液后的H終濃度為0.125～8 mg/L，R為0.03～32 mg/L(表1)，為初始配置時濃度的1/20。

2)Pa-Mfx組合及Pa、Mfx單藥MIC濃度測定微孔板配置范圍：配置方法同H+R，其中Pa的初始配置濃度為0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5、10、20、40、80、160 mg/L，Mfx為0.6、1.2、2.5、5、10、20、40 mg/L。使每孔在加入200 μl菌液后的Mfx終濃度為0.03～2 mg/L，Pa為0.0075～4 mg/L，均為初始配置時濃度的1/20。

3)Pa-Mfx-Rfb或Pa-Mfx-Rft組合及Rfb或Rft單藥MIC濃度測定微孔板配置范圍：將預先配置好的Rfb或Rft的5個初始濃度梯度溶液(Rfb為1.25、2.5、5、10、20 mg/L，Rft為10、20、40、80、160 mg/L)，分別加至含Pa和Mfx的5個96微孔板除A1外的所有孔中，再加入200 μl菌液，使Rfb的終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/L，Rft為1、2、4、8、16 mg/L，H12為單藥Rfb/Rft的5個不同濃度的MIC值。

表1 96孔微孔板藥敏試驗檢測H和R的藥品濃度(mg/L)

以Mfx-Pa-Rfb(0.125 mg/L)添加方法為例：(1)準備18支5 ml離心管，分別與96孔板對應標號，為2～12和B～H。取0.0125 ml預先配置好的10 mg/ml的Rfb備用溶液，加入100 ml包被液，制成1.25 mg/L的Rfb溶液，分別加入上述5 ml離心管中，從左2至右11分別加入2.5 ml，右12管加入5 ml；從上B至下G分別加入2.5 ml，下H管加入5 ml。(2)取0.08 ml預先配置好的Pa備用液(10 mg/ml)加入到配置好的12管Rfb溶液(1.25 mg/L，5 ml)中，形成含160 mg/L的Pa和含1.25 mg/L的Rfb的溶液Ⅰ，混勻后取2.5 ml溶液Ⅰ依次從右11號管往左到2號管加入到上述Rfb溶液(1.25 mg/L，2.5 ml)中進行梯度稀釋。(3)取0.02 ml預先配置好的Mfx備用液(10 mg/ml)加入到配置好的H管Rfb溶液(1.25 mg/L，5 ml)中，形成含40 mg/L的Mfx和含1.25 mg/L的Rfb的溶液Ⅱ。混勻后取2.5 ml溶液Ⅱ依次從下G號管往上到B號管加入到上述Rfb溶液(1.25 mg/L，2.5 ml)中進行梯度稀釋。(4)除A1孔外，第1行和第1列每孔各加入10 μl含1.25 mg/L的Rfb溶液，最終形成第一行和第一列的梯度濃度；H12孔加入20 μl含1.25 mg/L的Rfb溶液作為單藥對照。繼而將配置好的梯度溶液Ⅰ沿著Y軸從左2至右12每孔依次添加10 μl，將配置好的梯度溶液Ⅱ沿著X軸從上B至下H每孔依次添加10 μl，每孔混合后含液量均為20 μl，添加200 μl菌液后最終形成Mfx終濃度為0.03～2 mg/L，Pa為0.0075～8 mg/L，均為初始配置時濃度的1/20；Rfb為0.125 mg/L，為初始配置時濃度的1/10。

2.組合藥品藥敏試驗：取適量7H9液體培養基內生長至對數期的標準菌株(H37Rv)菌液，磨菌比濁至1個麥氏單位[約107菌落形成單位(CFU)/ml]，用7H9液體培養基以1∶100稀釋，使菌液濃度為105CFU/ml。取稀釋后的標準菌株菌液(200 μl/孔)加入12個不同含藥微孔板中，同時設置100%菌量生長對照孔加至A1孔和H12孔中，由于對照孔均位于邊緣，為防止干板情況同時設置復孔。以此對比在無抗培養情況下的菌株生長情況；封板后37 ℃培養，分別于7、10、14 d后將96孔板放置于配套用的倒置放大鏡上觀察并記錄結果，以孔底出現肉眼可見的白色菌體沉淀為陽性。標準菌株用以檢測12塊組合藥敏板效價，不計入92株研究菌株。以標準菌株為例，其余92株菌添加方法均以此為準。

3.相關定義：

1)H、R、Pa、Mfx、Rfb、Rft的單藥MIC定義為：A2～A12或B1～H1孔底菌體沉淀<100%菌量對照孔1(A1)或對照孔2(H12)所對應單藥的MIC值，MIC值越小表明抑菌效果越好。

2)兩藥聯合檢測的FICI定義為：組合96孔板陣列中除A1～A12和A1～H1外各孔底菌體沉淀<100%菌量對照孔所對應的2種藥品的濃度值與之前測得的兩種單藥MIC值之比的和，即：兩藥組合FICI=組合MIC[A]/單藥MIC[A]+組合MIC[B]/單藥MIC[B]，以FICI≤0.5為協同作用，0.54為拮抗。此處以H+R為例說明兩藥FICI的判定方法(圖1)。

3)3種藥品組合檢測的FICI定義為：藥品組合作用板陣列中除第1行和第1列外的孔底菌體沉淀<100%菌量對照孔所對應的3種藥品濃度值與之前測得的3種單藥MIC值之比的和，即：三藥組合FICI=組合MIC[A]/單藥MIC[A]+組合MIC[B]/單藥MIC[B]+組合MIC[C]/單藥MIC[C]。以FICI≤0.75為協同，0.754為拮抗[3]。

協同率=兩或三種組合藥品表現為協同作用的菌株數/總菌株數。

三、統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據的錄入和分析，考慮到樣本量較小，對計量資料采用中位數(四分位數) [M(Q1，Q3)]描述其離散趨勢，計量資料的比較采用Wilcoxon配對檢驗；計數資料以百分比(%)表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。均以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 96孔藥敏試驗板對H和R檢測 14 d后的菌株生長情況

結 果

一、不同藥品組合前后MIC檢測結果分析

單藥藥敏試驗結果顯示，H和R對大部分菌株的MIC值已經整體升高，中位數分別為4和24 mg/L，但仍有少部分菌株對單藥MIC值較敏感，均≤1 mg/L；而Mfx和Rfb的MIC中位數均為0.5 mg/L，抑菌效果較好。

單藥H或R與組合后的R或H、Rfb或Rft與其組合Mfx-Pa后的Rfb或Rft，以及Pa與其組合Mfx、Mfx-Rfb或Mfx-Rft后的MIC值差異均有統計學意義(P值均<0.001)，且組合后的MIC值明顯低于組合前，Mfx與其組合Pa后的MIC值差異有統計學意義(P值<0.05)；但Mfx與其組合Pa-Rfb 或Pa-Rft后的MIC值差異均無統計學意義(表2)。

二、組合藥品的藥敏試驗檢測結果分析

H-R、Mfx-Pa、Mf-xPa-Rfb、Mfx-Pa-Rft藥品組合對92株菌的FICI數值范圍分別為0.06～4、0.14～4、0.09～4.75、0.15～6.5，各組合藥品表現為協同作用、不相關、拮抗的菌株分布株數見表3。

采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗分布情況，顯示H-R與Mfx-Pa、Mfx-Pa-Rfb與Mfx-Pa-Rft藥品組合的分布差異均無統計學意義(Fisher精確概率法，P=0.190；χ2=1.645，P=0.439)，而H-R和Mfx-Pa與Mfx-Pa-Rfb、Mfx-Pa-Rft的分布差異均有統計學意義(χ2=12.670，P=0.002；χ2=19.420，P<0.001；χ2=18.640，P<0.001；χ2=28.500，P<0.001)。

三、4種組合藥品的藥敏檢測結果的分層分析

1.不同耐藥菌株對4種組合藥品的FICI值：92株不同耐藥菌株對4種組合藥品的FICI值見表4。

表2 不同藥品組合前后MIC對比結果

表3 92株菌株不同FICI值在4種組合藥品中的分布情況

表4 不同組合藥品對不同耐藥MTB菌株的FICI值[M(Q1，Q3)]

表5 不同耐藥菌株藥品間作用情況在4種組合藥品中的分布

1)MDR-MTB分布情況：H-R與Mfx-Pa、Mfx-Pa-Rfb組合藥品的分布差異均無統計學意義(Fisher精確概率法，P=0.674；χ2=0.084，P=0.772)，與Mfx-Pa-Rft的分布差異有統計學意義(χ2=9.550，P=0.008)；Mfx-Pa與Mfx-Pa-Rfb和Mfx-Pa-Rft的分布差異均有統計學意義(χ2=0.872，P=0.350；χ2=13.300，P=0.001)；Mfx-Pa-Rfb與Mfx-Pa-Rft的分布差異無統計學意義(χ2=2.306，P=0.316)。

2)XDR-MTB分布情況：H-R組合藥品與Mfx-Pa 的分布差異無統計學意義(Fisher精確概率法，P=0.489)，與Mfx-Pa-Rfb和Mfx-Pa-Rft的分布差異均有統計學意義(χ2=10.020，P=0.007；χ2=10.710，P=0.005)；Mfx-Pa與Mfx-Pa-Rfb和Mfx-Pa-Rft的分布差異均有統計學意義(χ2=13.230，P=0.001；χ2=14.360，P=0.001)；Mfx-Pa-Rfb與Mfx-Pa-Rft的分布差異無統計學意義(χ2=0.066，P=0.967)。

2.分層分析不同方案對不同耐藥菌株的協同作用：對不同耐藥菌株的分層分析結果見表5。

討 論

我國現行的復治結核病標準化學治療方案，是一線抗結核藥品的再組合及疊加，已不適合應對目前復治結核病高耐藥率的現狀，極易導致治愈率下降、不良反應加重、療程延長、中斷治療，是造成MDR-TB發生的重要原因，不利于我國“三病兩率”的控制[7]，亟需研究新的更有效的治療組合方案，而體外聯合藥敏試驗可以準確評估不同藥品組合對不同耐藥性MTB的抑制活性，為臨床制定治療方案提供有效依據。

本研究通過對92株首次復治肺結核患者痰標本分離的耐藥MTB行聯合藥敏檢測，評價標準方案和新方案體外聯合藥敏試驗的檢測效果。由于既往對敏感菌株進行組合藥品藥敏檢測時，發現每種藥品的MIC值遠遠低于該藥品單藥的正常檢測范圍，為進一步準確判斷FICI值，本研究通過檢測不同組合藥品對耐藥菌株的作用，為臨床選擇合適的抗結核化學治療方案，尤其是針對耐藥結核病患者提供了治療方案的依據。而且，本研究當結果統計中出現單藥孔最高濃度中菌落長滿的情況時，會升高兩個濃度重復實驗；當出現單藥孔最低濃度菌落不生長的情況時，會下降兩個濃度重復實驗，以確保結果的可靠性。

H和R是標準方案的核心藥品，但實際上很多復治患者均已經對其中1種甚至2種藥品產生耐藥，再用來治療并不合理，效果較差。在本研究的組合藥品中，引入了Mfx、Pa和Rfb、Rft，考慮Mfx是氟喹諾酮類中殺菌效果較好的藥品，單藥MIC值低(本研究中的單藥MIC值為0.5 mg/L)，且具有不良反應輕微、生物利用度高、組織滲透性強、消除半衰期長、與其他抗菌藥品無交叉耐藥性等特點[8]；Pa是一種復合制劑，是由異煙肼和對氨基水楊酸組成的分子化合物，對部分耐異煙肼或對氨基水楊酸的菌株仍敏感[9]，可使與Mfx、Mfx+Rfb或Mfx+Rft組合后單藥的MIC值明顯下降(P值均<0.001)；而Rfb和Rft均為R的衍生物，三者具有高度的交叉耐藥性，但有研究表明Rfb和Rft對低耐R的菌株仍保留一定的殺菌活性，尤以Rfb的效果顯著[10-11]，與本研究Rfb的單藥MIC值明顯低于Rft的單藥MIC值的結果一致。

本研究不僅分析Mfx-Pa與H-R的藥敏試驗效果，也在Mfx和Pa兩藥組合的基礎上分析Rfb或Rft與二者組合使用時對耐藥MTB的作用效果，并與標準方案中H和R的組合藥敏效果進行對比，進一步分析H-R、Mfx-Pa、Mfx-Pa-Rfb、Mfx-Pa-Rft 4種藥品方案的組合作用。通過兩藥組合比較可以看到，H和R在組合后MIC值下降幅度均比較大，差異均有統計學意義，說明H和R兩藥組合有較好的協同作用；而Mfx和Pa組合后，Mfx本身的MIC值無變化，但Pa的MIC值從原來的中位數8 mg/L下降至0.0075 mg/L(P<0.001)，表明Mfx可促進Pa的抑菌作用；但Mfx和Pa組合后的協同率(5.4%)低于H-R組合(12.0%)，FICI值(1.5)高于H-R組合(1.25)，提示Mfx-Pa較H-R不能實現更好的抑菌效果，必須再引入第三種藥品，如利福平類藥物[12-13]。而Rfb或Rft分別與Mfx-Pa組合后，是否會優于H-R組合，是下一步需研究解決的問題。

進一步研究發現，3藥組合后的協同率明顯高于兩藥組合，差異均有統計學意義，Mfx-Pa-Rfb或Mfx-Pa-Rft組合藥品的協同率(17.4%和23.9%)明顯高于H-R、Mfx-Pa，與我們前期研究結果一致[4]。而Mfx-Pa-Rfb的協同率雖低于Mfx-Pa-Rft，但差異無統計學意義 (χ2=1.645，P=0.439)，與我們前期的研究結論“Mfx-Pa-Rft組合藥品的協同作用明顯高于Mfx-Pa-Rfb”[4]有所不同。考慮到本次研究樣本量是前期研究的2.3倍，XDR-MTB菌株的數量顯著增多，且均來源于臨床首次復治肺結核患者，應該更具有代表性，結果更可靠。

進一步分層分析發現， Mfx-Pa-Rft對單耐H、MDR-MTB、XDR-MTB的協同率均比Mfx-Pa-Rfb高，FICI值均低于Mfx-Pa-Rfb，提示Mfx-Pa-Rft方案更有效。XDR-MTB和MDR-MTB菌株在H-R、Mfx-Pa方案中的協同率和不相關率均相同，均無拮抗。而在兩種三藥組合中XDR-MTB的協同率(16.7%和18.5%)均低于MDR-MTB(19.4%和30.6%)，拮抗率(14.8%和14.8%)均高于MDR-MTB(5.6%和11.1%)，提示XDR-MTB菌株不僅耐單藥數量多，也極易對三藥組合產生拮抗，提示制訂XDR-TB患者治療方案時，不僅要關注單藥的耐藥性，也要明確治療方案對不同耐藥菌的組合作用效果，應通過組合藥品的藥敏檢測，選擇協同率更高的藥品組合。

綜上所述，本課題在“十二五”研究基礎上進一步優化藥敏試驗方法、增加樣本量，驗證了新方案中Mfx-Pa-Rfb或Mfx-Pa-Rft組合藥品的協同效果。Rfb的單藥抑菌效果好于Rft，但在Mfx-Pa-Rfb和Mfx-Pa-Rft中，Rfb的協同效果卻低于Rft的協同效果，且XDR-MTB菌株不僅對耐單藥種類多，也易對組合的藥品產生拮抗作用，提示針對不同耐藥患者選擇藥品時，不僅應關注單藥的抑菌效果，也要考慮藥品間組合使用的互相影響。后續我們將結合臨床治療結果對比復治患者不同方案治療前后FICI值、MIC值的變化，分析研究組合藥品藥敏檢測在治療療效評估中的應用價值。

志謝復旦大學公共衛生學院王偉炳教授對本研究統計學處理進行了指導和幫助。