基于有效基準特征圖譜質量表征的丁香質量評價研究

武秋紅 孔靜 黃玉娟 范圓圓 李思潼 劉路路 高園園 陳思玉 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

丁香，始載于《藥性本草》，是桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾，屬于“藥食同源物品”之一，其性溫，味辛，歸脾、胃、腎經，具有溫中止痛、降逆的作用，用于治療脾胃虛寒、呃逆嘔吐、食少吐瀉、心腹冷痛和腎虛陽痿[1]。

文獻表明，丁香主要含有黃酮類、苯丙素類、酚酸類、三萜類等化學成分[2]。有文獻分別報道對丁香中的苯丙素類成分丁香酚，黃酮類成分蘆丁、槲皮素，三萜類成分齊墩果酸、熊果酸、山楂酸、科羅索酸、白樺脂酸進行含量進行測定[3-5]，對酚類成分丁香酚、阿魏酸、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量測定及指紋圖譜研究[6]；2015年版《中華人民共和國藥典》以丁香酚的含量作為丁香飲片質量標準指標[7]。

筆者在對理氣類藥食同源藥味質量表征研究中，發現丁香具有確切的促胃動力功效作用(左旋精氨酸所致大鼠胃動力障礙模型下，大鼠胃殘留率、血漿胃動素，給藥組與模型組比較P<0.01)。本文報道在本課題組前期建立的中藥質量評價模式基礎上[8-16]，進一步研究建立有效基準特征圖譜質量表征模式、方法與質量評價。即以確定有促胃動力作用的丁香飲片作為飲片基準，以具有促胃動力功效的代表性成分及其含量作為質量表征基準點，采用HPLC-PDA(高效液相色譜-二極管陣列檢測器；High Performance Liquid Chromatography-Photo-diode Array)建立丁香有效基準特征圖譜，涵蓋其提取物促胃動力藥物體系之藥學架構主要化學類型：酚酸類、黃酮類、苯丙素類、三萜類；基于對照品模擬基準點的有效基準特征圖譜質量表征信息作為評價丁香飲片的質量標尺，并對其準確性進行佐證及質量評價應用與驗證。以精準、有效、簡易地評價丁香飲片的質量，為丁香的應用提供科學依據，也為有關藥物的質量有效評價與控制提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695自動進樣高效液相色譜儀，2998PDA檢測器，Empower工作站；XS205型1/100000電子分析天平和AL204型1/10000電子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；Serial型數控超聲波清洗器(北京市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑

沒食子酸對照品(批號：110831-201204，純度≥98%)、異槲皮苷對照品(批號：P25J9F65872，純度≥98%)、丁香酚對照品(批號：Z03D5Y7，純度≥98%)、山楂酸對照品(批號：Z24F9B54635，純度≥98%)、齊墩果酸對照品(批號：HA0820KA14，純度≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司；色譜級乙腈，購自Fisher Scientific公司；純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司；分析甲醇。從各藥店購得的15批丁香飲片，其中S10為前期藥效實驗中確定有促胃動力作用的丁香飲片(飲片基準)，由北京中醫藥大學鑒定系劉春生教授鑒定，所購丁香飲片都是正品飲片，丁香飲片的采購地點、產地、批號見表1，留樣飲片存儲于北京中醫藥大學良鄉校區中藥化學系。

表1 15批丁香飲片的產地、批號及采購地點

2 方法與結果

2.1 有效基準特征圖譜質量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品3.93 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品溶液(a)；精密稱取異槲皮苷對照品2.95 mg，置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異槲皮苷對照品溶液(b)；精密稱取丁香酚對照品21.67 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得丁香酚對照品溶液(c)；精密稱取山楂酸對照品3.91 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得山楂酸對照品溶液(d)；精密稱取齊墩果酸對照品5.92 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得齊墩果酸對照品溶液(e)；分別精密量取a、b、c、d、e對照品溶液各1.0 mL、0.5 mL、5.0 mL、1.0 mL、1.0 mL置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸濃度分別為：39.300 μg/mL、7.375 μg/mL、1.0835 mg/mL、39.100 μg/mL、59.200 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取過二號篩的丁香飲片基準(S10)粉末及待評價飲片粉末約0.25 g，精密稱定，置于100 mL具塞的錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定其重量，加熱回流提取2次，每次1小時，冷卻至室溫，再稱定其重量，用80%甲醇補足失重，搖勻，濾過，用少量80%甲醇分次洗滌容器和殘渣，濾過，將濾液與洗滌液合并于100 mL圓底燒瓶中，50℃減壓濃縮，并完全轉移至25 mL棕色容量瓶，冷卻至室溫，80%甲醇定容至刻度線，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測條件 XBridge Shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-2%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～10分鐘，5%～6%A；10～30分鐘，6%～22%A；30～50分鐘，22%～23%A；50～70分鐘，23%～47%A；70～75分鐘，47%～75%A；75～100分鐘，75%A)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長：215 nm，進樣量20 μL，采集時間：100分鐘。

丁香飲片(S10)樣品、混合對照品在以上色譜檢測條件下的HPLC色譜圖，見圖1。

14個色譜峰在圖譜中顯示分離度良好，通過與沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸對照品紫外吸收光譜對比，判斷14個特征峰對應的化學成分類型，涵蓋了丁香酚酸類、黃酮類、苯丙素類、三萜類4種主要化學成分類型。

注：A供試品；B混合對照品；1沒食子酸；2異槲皮苷；3丁香酚；4山楂酸；5齊墩果酸；6、7酚酸類成分；8、9、10、11、12、13黃酮類成分；14苯丙素類成分。

2.1.4 有效基準特征圖譜方法學考察 (1)精密度考察：按2.1.2項下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件，連續進樣6次測定，以丁香酚為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積的RSD均小于1.32%，相對保留時間的RSD均小于1.26%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜要求(RSD≤3%)[17]。(2)穩定性考察：按2.1.2項下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣測定，以丁香酚為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積的RSD均小于1.42%，相對保留時間的RSD均小于1.56%，表明供試品溶液在24小時內基本穩定(RSD≤3%)[17]。(3)重復性考察：取丁香飲片(S10)，按2.1.2項下方法平行制備丁香飲片(S10)供試品溶液6份，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣測定，以丁香酚為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積的RSD均小于2.12%，相對保留時間的RSD均小于1.82%，表明本方法重復性良好(RSD≤3%)[17]。

2.1.5 代表性成分含量測定方法學考察 (1)線性關系考察：按2.1.1項下制備混合對照品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣2、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μL，測定代表性成分峰面積，以對照品的量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，線性方程相關系數r均大于0.99，表明線性范圍符合測定要求(r≥0.99)[17]。見表2。(2)精密度考察：按2.1.2項下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件，連續進樣6次測定，計算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸峰面積的RSD均小于2.63%，表明儀器精密度良好，符合含量測定要求(RSD≤3%)[17]。(3)穩定性考察：按2.1.2項下制備丁香飲片(S10)供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣測定，計算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸峰面積的RSD均小于2.25%，表明供試品溶液在24小時內穩定性良好(RSD≤3%)[17]。(4)重復性考察：取丁香飲片(S10)，按2.1.2項下方法平行制備丁香飲片(S10)供試品溶液6份，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣測定，結果表明本飲片樣品中沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸的平均含量分別為0.4175%、0.0610%、15.7583%、0.3186%、0.5795%，RSD分別為1.21%、2.88%、1.46%、2.28%、1.90%，表明本方法重復性良好(RSD≤3%)[17]。(5)加樣回收率考察：精密稱取沒食子酸對照品5.21 mg、丁香酚對照品196.86 mg、山楂酸對照品4.83 mg、齊墩果酸對照品7.30 mg置同一10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(f)；精密稱取異槲皮苷對照品2.84 mg置20 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得異槲皮苷對照品溶液；取已知特征代表性成分含量的過二號篩的丁香飲片(S10)粉末6份，約0.125 g，精密稱定，分別置于6個100 mL具塞錐形瓶中，同時精密量取混合對照品溶液(f)1.0 mL、異槲皮苷對照品溶液0.5 mL置以上6個100 mL具塞錐形瓶中，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算沒食子酸、異槲皮苷、丁香酚、山楂酸、齊墩果酸的平均加樣回收率分別為100.33%、97.90%、100.12%、96.89%、101.45%，RSD分別為2.20%、1.92%、1.84%、2.82%、1.83%，表明本方法準確可靠(回收率在95%～102%之間，RSD≤3%)[17]。見表3。

2.1.6 模擬基準點質量表征考察 文獻報道丁香酚具有促胃動力作用[1]，因此以丁香酚作為質量表征基準點。精密稱取丁香酚對照品7.87 mg，至5 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.574 mg/mL的丁香酚對照品溶液作為模擬基準點，與2.1.2項下制備的丁香飲片(S10)供試品溶液中所檢測的丁香酚含量相同，按2.1.3項下色譜檢測條件進樣測定，得模擬基準點的HPLC色譜圖，見圖2。

表3 加樣回收率考察結果(n=6)

續表

由模擬基準點色譜圖可得丁香酚對照品的保留時間及峰面積與丁香有效基準特征圖譜中丁香酚的保留時間及峰面積相吻合，表明所建立的檢測方法及其檢測結果與模擬丁香質量表征基準點具有準確性，即丁香酚對照品溶液(1.574 mg/mL)可作為模擬表征點。

2.2 有效基準特征圖譜質量表征信息

有效基準特征圖譜中14個特征峰的保留時間、峰面積(以100 mg丁香飲片計)、含量，以模擬基準點為基準得到的相對保留時間、相對峰面積、相對含量，換算系數(代表性成分的相對含量/代表性成分的相對峰面積)，見表4。

表4 14個特征峰的保留時間、峰面積、含量、相對保留時間、相對峰面積、相對含量、換算系數

以上可得，基于模擬基準點得到的14個特征峰及其相對保留時間、相對峰面積，5個代表性成分的相對含量，即為丁香有效質量基準標尺。

2.3 評價與驗證

取14批待評價丁香飲片，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件進樣檢測，得到的14批待評價丁香飲片質量表征信息，同時實測丁香飲片S10(基準)有效基準特征圖譜，以及實測14批待評價丁香飲片代表性成分含量，以驗證基于質量標尺進行丁香質量評價的準確性。如圖3、4、5、6，以及表5所示。

如圖3、4所示，14批丁香飲片特征圖譜皆含有14個相同的特征峰，且14個特征峰相對保留時間與基準標尺基本一致，同時也與實測值相吻合。結果表明：14批皆為丁香飲片，且驗證了應用基準標尺辨別丁香飲片真偽的準確性。

圖3 14批丁香飲片與基準(S10)的HPLC特征圖譜(215 nm)

圖4 14批丁香飲片與基準(S10)相對保留時間

由圖5、6可見14批丁香飲片質量表征信息，根據其特征峰相對峰面積及其相對含量高于其基準標尺對應點的數目、幅度和所涵蓋的4種主要化學類型及其丁香酚同類成分，綜合考量評價得出樣品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7質量較優。

圖5 14批丁香飲片與基準(S10)的相對峰面積

圖6 14批丁香飲片與基準(S10)的相對含量

由表5可得，換算含量與實測含量基本一致，即驗證了代表性成分換算含量結果的準確性及其相對含量結果的準確性。

表5 14批丁香飲片中5個特征代表性成分的含量(%；n=2)

3 討論

本研究在自然藥學觀相關理論的指導下[18-21]，建立了丁香有效基準特征圖譜質量表征方法，丁香飲片中的14個特征峰覆蓋了苯丙素類、黃酮類、酚酸類、三萜類這四種化學成分類型，其中，丁香酚具有健脾胃的作用[1]、沒食子酸具有抗消化性潰瘍的作用[22]、齊墩果酸具有抗胃潰瘍的作用[23]、異槲皮苷具有對人胃癌細胞SGC-7901增殖抑制及誘導凋亡作用[24]，苯丙素類成分具有健胃的作用[1]，黃酮類、酚酸類、三萜類成分均對消化系統有積極作用[25-26]，從而整體反映了丁香的有效物質基礎。同時構建了丁香質量評價模式，并對14批丁香飲片進行了飲片質量優良度評價，經構建的丁香質量評價模式分析可知：樣品S13、S2、S9、S14、S15、S3和S7質量較優。建立的丁香基準有效特征圖譜質量表征模式、方法能夠整體、準確、簡易地對丁香飲片進行質量表征，構建的丁香質量評價模式關注了丁香飲片質量的精確性與應用有效性，為丁香的質量評價與篩選及其藥物質量的精準預期提供了依據。