SOX6 基因?qū)2 O2 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的機(jī)制

巨 虎,肖宗宇,張廣華,許常林

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西寧 810000)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte,AS)是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目眾多的細(xì)胞之一,具有復(fù)雜多樣的生物學(xué)特性,帕金森綜合征、阿爾茨海默癥等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均與AS 細(xì)胞活化及功能異常有關(guān)[1-2]。 過氧化氫(H2O2)是人體內(nèi)的主要活性氧簇(ROS),有研究證實(shí),H2O2可誘導(dǎo)AS 細(xì)胞凋亡,而降低H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可減少AS 凋亡[3-4]。 目前已有大量研究使用H2O2建立AS 細(xì)胞的氧化損傷模型[5]。SOX6 是SOX 基因家族D 亞家族成員之一,參與了早期胚胎發(fā)育及器官形成過程,是軟骨、肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中一個(gè)重要的調(diào)控因子[6]。 有研究顯示,向大鼠側(cè)腦室注射miR-219 激動(dòng)劑可抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞中SOX6 的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞成熟,從而改善由脂多糖導(dǎo)致的全身炎癥所引起的新生鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟障礙[7];miR-499 過表達(dá)可通過直接靶向SOX6 抑制抗缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖,降低LDH 漏出量,抑制細(xì)胞凋亡[8]。以上研究提示SOX6 基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中有重要作用。 但SOX6 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞損傷影響及機(jī)制尚未明確。 因此,本研究通過RNA 干擾技術(shù)沉默AS 細(xì)胞SOX6 表達(dá),旨在探討SOX6 表達(dá)抑制對(duì)AS 細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠2 只,體重(200±20)g,購自上海市公共衛(wèi)生臨床中心[SCXK(滬)2015-0002],[SYXK (青) 2016-0001]。 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基(貨號(hào):12800-082)、FBS(貨號(hào):100099141)均購自美國Gibco 公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):P0012)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;LDH 試劑盒(貨號(hào):MAK066)購自美國Sigma 公司;Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):KGA108-1)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;JC-1 探針(貨號(hào):T3168)購自美國Molecular Probes;SOX6 抗體(貨號(hào):ab64946)購自英國Abcam;Cyt.C(貨號(hào):12963)、caspase3(貨號(hào):9662)、caspase9(貨號(hào):9502)、Bcl-2(貨號(hào):3498)、Bax(貨號(hào):2772)和p-AKT 抗體(貨號(hào):4060)均購自美國CST;MultiskanTMFC 酶標(biāo)儀購自美國Thermo;FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠AS 取材及培養(yǎng)

參照McCarthy 等[9]方法加以調(diào)整,建立AS 體外純化培養(yǎng)體系。 無菌條件下取大鼠大腦,DHanks 緩沖液漂洗,眼科剪剝離血管和腦膜,剪碎大腦皮質(zhì),用胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化,然后加入DMEM 完全培養(yǎng)基,離心,棄掉上清,用含15% FBS 的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,以200 目篩網(wǎng)過濾,接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h,取出未貼壁的細(xì)胞懸液,以1.0×106/mL 濃度接種于培養(yǎng)皿內(nèi),于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),2～3 d 更換一次培養(yǎng)液,8 ～9 d 細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí),37℃震蕩以去除小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞,PBS 液洗滌,換液,繼續(xù)培養(yǎng)1 d后,胰酶消化傳代。 取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

本實(shí)驗(yàn)共分為4 組,即陰性對(duì)照組(NC 組):AS轉(zhuǎn)染無干擾作用的siRNA;H2O2組:20 μmol/L 的H2O2處理AS 細(xì)胞24 h;H2O2+NC 組:無干擾作用的siRNA 轉(zhuǎn)染AS 細(xì)胞24 h 后,20 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞24 h;H2O2+si-SOX6 組:SOX6 特異性siRNA 轉(zhuǎn)染AS 細(xì)胞24 h 后,20 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞24 h。 其中siRNA 轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染說明(美國Invitrogen),轉(zhuǎn)染前1 d,以2×105個(gè)/孔接種第3 代AS 細(xì)胞于6 孔板,于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)60%～70%融合度,分別制備NC 及si-SOX6 與LipofectamineTM2000 復(fù)合物,將復(fù)合物加入6 孔板相應(yīng)孔內(nèi),于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育6 h,棄上清培養(yǎng)液,加入DMEM 完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h。

1.3.3 Western blotting

加入適量的RIPA 裂解液提取總蛋白,BCA 法檢測(cè)蛋白濃度,蛋白與適量5×上樣緩沖液混勻,100℃,5 min,煮沸變性。 上樣,每孔道40 μg,經(jīng)SDS-PAGE 分離蛋白,轉(zhuǎn)PVDF 膜,室溫?fù)u床封閉1 h,將膜加入已稀釋的一抗中(1 ∶1000),4℃孵育過夜,洗膜3 次,加稀釋好的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1 ∶3000),室溫?fù)u床輕微搖動(dòng)孵育1 h,洗膜,顯影。Quantity One 軟件目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 LDH 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性

收集按照1.3.2 處理的各組細(xì)胞上清液,根據(jù)LDH 試劑盒說明配制試劑盒并加樣,在37℃反應(yīng)30 min,酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm 各孔吸光度值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集按照1.3 處理的各組細(xì)胞,PBS 洗滌細(xì)胞,1×Annexin-binding buffer 200 μL 重懸細(xì)胞,分別加Annexin V-FITC 和PI 各5 μL,避光室溫反應(yīng)15 min,再加入1× Annexin-binding buffer 400 μL,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)(1 h 內(nèi))。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.6 線粒體膜電位檢測(cè)

收集按照1.3 處理的各組細(xì)胞,PBS 洗滌細(xì)胞,加入10 μg/mL 的JC-1,在37℃孵箱中孵育30 min,棄去細(xì)胞液體,PBS 洗滌細(xì)胞,以洗盡JC-1 殘余,通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光情況。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示,采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾SOX6 表達(dá)效果

通過Western blotting 檢測(cè)SOX6 特異性siRNA轉(zhuǎn)染AS 細(xì)胞效果,結(jié)果如圖1 所示,H2O2可明顯上調(diào)AS 細(xì)胞SOX6 蛋白表達(dá),而細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-SOX6 后SOX6 表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。

圖1 SOX6 特異性siRNA 轉(zhuǎn)染AS 細(xì)胞效果(n=3)Figure 1 Effects of SOX6-specific siRNA transfection on AS cells

2.2 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞毒性影響

如圖2 所示,H2O2處理AS 細(xì)胞后,細(xì)胞毒性明顯升高,而轉(zhuǎn)染si-SOX6 后細(xì)胞毒性明顯降低(P＜0.05)。

2.3 干擾SOX6 可抑制H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3 所示,H2O2可明顯促進(jìn)AS 細(xì)胞凋亡,而細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-SOX6 可明顯減弱H2O2對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用(P＜0.05)。

2.4 干擾SOX6 可提高H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞線粒體膜電位

運(yùn)用JC-1 探針,采用激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化,結(jié)果如圖4 所示,H2O2可明顯降低AS 細(xì)胞膜電位,干擾SOX6 后細(xì)胞膜電位明顯升高(P＜0.05)。

2.5 干擾SOX6 可抑制H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞線粒體凋亡

如圖5 所示,H2O2可明顯上調(diào)Cyt.C、caspase3和Bax 表達(dá),下調(diào)Bcl-2 表達(dá),而干擾SOX6 表達(dá)可減弱H2O2對(duì)Cyt.C、caspase3、caspase9 和Bcl-2 表達(dá)下調(diào)及Bax 表達(dá)上調(diào)作用(P＜0.05)。

2.6 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響

如圖6 所示,H2O2可明顯下調(diào)p-AKT 表達(dá),而干擾SOX6 表達(dá)后p-AKT 表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。

3 討論

AS 細(xì)胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各個(gè)區(qū)域,與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 目前認(rèn)為這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激存在密切關(guān)系[10]。 AS 細(xì)胞是一類易受損敏感的細(xì)胞,氧化損傷后可阻礙其保護(hù)功能,從而成為神經(jīng)損傷發(fā)展過程中的促進(jìn)因子[11]。 因此,保護(hù)AS 細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷,對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病損傷保護(hù)具有重要意義。

圖2 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞毒性影響(n=3)Figure 2 Effects of SOX6 interference on toxicity of AS cells induced by H2O2

圖3 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞凋亡影響(n=3)Figure 3 Effects of SOX6 interference on apoptosis of AS cells induced by H2O2

圖4 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞膜電位的影響(n=3)Figure 4 Effects of SOX6 interference on membrane potential of AS cells induced by H2O2

SOX6 是SOX 基因家族D 亞家族成員之一,是一個(gè)關(guān)鍵的器官發(fā)展及細(xì)胞分化調(diào)節(jié)器,參與神經(jīng)分化和神經(jīng)發(fā)育過程[12]。SOX6 對(duì)AS 細(xì)胞生長影響及機(jī)制尚未明確。 已有研究表明,過表達(dá)miR-499 可通過靶向SOX6 抑制抗缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制LDH 漏出,并抑制細(xì)胞凋亡[8]。 鑒于此,本研究通過RNA 干擾技術(shù)沉默AS 細(xì)胞SOX6 表達(dá),研究抑制SOX6 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果顯示,H2O2可明顯上調(diào)AS 細(xì)胞表達(dá),而干擾SOX6 表達(dá)后細(xì)胞SOX6表達(dá)明顯降低。 說明成功建立了抑制SOX6 表達(dá)的AS 細(xì)胞,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制SOX6 表達(dá)可明顯降低H2O2對(duì)AS 細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用,提示抑制SOX6 表達(dá)可降低AS 細(xì)胞損傷。

圖5 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響(n=3)Figure 5 Effect of SOX6 interference on the expression of mitochondrial apoptosis pathway-related proteins in AS cells induced by H2O2

圖6 干擾SOX6 對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響(n=3)Figure 6 Effect of SOX6 interference on PI3K/AKT signaling pathway in AS cells induced by H2O2

研究表明,細(xì)胞中線粒體膜電位降低,可促進(jìn)細(xì)胞色素C(Cyt.C)釋放至胞漿,最終激活caspase家族酶caspase3,從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[13-15]。 在細(xì)胞中,Bcl-2 和Bax 分別通過調(diào)控下游基因發(fā)揮抗凋亡作用和促凋亡作用,Bcl-2 可通過阻礙線粒體破壞、Cyt.C 釋放及caspase 家族激活,從而抵抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16-17]。 有研究表明,H2O2刺激可明顯降低AS細(xì)胞線粒體膜電位[18]。 本研究結(jié)果顯示,干擾SOX6 表達(dá)可明顯提高線粒體膜電位,下調(diào)Cyt.C、caspase3 和Bax 表達(dá),上調(diào)Bcl-2 表達(dá),提示干擾SOX6 表達(dá)可通過線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)AS細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

PI3K/AKT 信號(hào)通路通過多種途徑調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡等過程,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活至關(guān)重要。 有研究證實(shí),PI3K/AKT 信號(hào)通路參與帕金森氏病、阿爾茨海默癥等動(dòng)物模型的發(fā)病過程[19-20]。 也有多項(xiàng)研究表明,激活PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)損傷有保護(hù)作用[21-22]。 AKT 是PI3K/AKT 信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié),AKT 活化后可通過調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因表達(dá)而影響細(xì)胞生物學(xué)過程。 有研究表明,氧化應(yīng)激可明顯抑制AS 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路[23-24]。 本研究結(jié)果顯示,干擾SOX6 表達(dá)可明顯上調(diào)H2O2誘導(dǎo)的AS 細(xì)胞中p-AKT 表達(dá)。 提示干擾SOX6 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)AS 細(xì)胞凋亡的影響與激活PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在AS 細(xì)胞中干擾SOX6 基因表達(dá)可通過抗凋亡途徑保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的AS 損傷,此保護(hù)作用與線粒體通路及PI3K/AKT信號(hào)通化激活有關(guān)。 提示SOX6 在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的重要作用,值得進(jìn)一步深入探究。