卵清蛋白(OVA)致敏聯(lián)合煙熏法建立咳嗽變異型哮喘豚鼠模型

呂天宜李得民楊道文程思益

(中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病科中日友好醫(yī)院呼吸中心國家呼吸疾病臨床研究中心,北京 100029)

咳嗽變異型哮喘(CVA)是慢性咳嗽的主要病因之一,也被認(rèn)為是哮喘的前期先兆[1-2]。一方面CVA 在病理特征上與典型哮喘相似,另一方面其在咳嗽癥狀與氣道高反應(yīng)性(AHR)上與典型哮喘有一定的差異[3]。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中最常見的咳嗽變異型哮喘造模方法為卵清蛋白致敏法,CVA 的發(fā)病可能與接觸過敏原相關(guān)為這一造模方法提供理論依據(jù)[4-5]。但在 OVA 致敏豚鼠 CVA 模型中,受試動(dòng)物常出現(xiàn)對于OVA 的免疫過度反應(yīng),使得CVA 模型反而更趨近于哮喘模型[6-7]。近些年來,研究人員提出煙熏的方法可以提高模型動(dòng)物的咳嗽敏感性[8-9]。因此,本實(shí)驗(yàn)組嘗試以O(shè)VA 致敏聯(lián)合煙熏法建立相似度更高的豚鼠CVA 模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級豚鼠24 只,雌雄各半,體重280～320 g,6周齡,購于北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心[SCXK(京)2018-0010],飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所[SYXK(京)2019-0002],研究方案經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院委員會(huì)機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC 20193001),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

高純度卵清蛋白(批號(hào):A8041,純度≥60%)購自Solarbio 公司(中國);氫氧化鋁(批號(hào):A7130)購自Solarbio 公司(中國);二氫辣椒堿(批號(hào):YZ-111666)購自Solarbio 公司(中國);乙酰甲膽堿(批號(hào):62-51-1)購自sigma 公司(美國);本實(shí)驗(yàn)所用香煙為“中南海”彩色纖維素粒子濾嘴香煙(北京卷煙廠;焦油量8 mg;煙氣煙堿量0.7 mg;煙氣一氧化碳量10 mg)。熒光正置顯微鏡(廠家:日本奧林巴斯,型號(hào):BX53);離心機(jī)(廠家:日本久保田,型號(hào):6500);動(dòng)物無創(chuàng)肺功能儀與氣道阻力和肺順應(yīng)性檢查系統(tǒng)(RC 系統(tǒng))(廠家:美國DSI 公司,型號(hào):BUXCO);壓縮霧化吸入機(jī)(德國PARI 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑制備

0.2 %卵清蛋白溶液:將2 mg OVA 和100 mg 氫氧化鋁溶于1 mL 生理鹽水(NS)中配置成;卵清蛋白增敏溶液:將0.01 mg OVA 和100 mg 氫氧化鋁溶于1 mL NS 中;1.0%卵清蛋白溶液:將100 mg OVA溶于10 mL NS 中。辣椒素溶液:將30.5 mg 二氫辣椒堿溶于1 mL 吐溫-80 溶液與1 mL 無水乙醇中,再加入8 mL NS 配置成10-2mol/L 原液,取 1 mL 10-2mol/L 原液,加入100 mL NS 配置成10-4mol/L辣椒素溶液。乙酰甲膽堿溶液:將0.8 mg 乙酰甲膽堿溶于1 mL NS 中,取0.75 mL 0.8 mg/mL 乙酰甲膽堿溶液加入0.25 mL NS 配置成0.6 mg/mL 乙酰甲膽堿,將0.8 mg/mL 溶液對倍稀釋成0.4 mg/mL和0.2 mg/mL 乙酰甲膽堿溶液。

1.3.2 建模與分組處理

(1)煙熏箱與使用方法

煙熏箱為定制的長、寬、高分別為70 cm×45 cm×50 cm 的玻璃箱體。每次放入4 個(gè)煙熏盒,每個(gè)煙熏盒中放入2 只豚鼠,共8 只豚鼠,在煙熏盤中點(diǎn)燃3 只香煙,每次煙熏30 min。

(2)模型制備方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組,分為空白對照組、OVA 致敏組與OVA 致敏+煙熏組,每組8 只豚鼠,雌雄各半,共24 只豚鼠。24 只豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。第4天OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組每只豚鼠腹腔注射0.2%卵清蛋白溶液1 mL,空白組腹腔注射NS 1 mL;第11 天OVA 致敏組與OVA 致敏+煙熏組每只豚鼠腹腔注射增敏卵清蛋白溶液1 mL,空白組腹腔注射 1 mL NS;第 18 ～ 24 天 OVA 致敏組與 OVA 致敏+煙熏組每只豚鼠以1.0%卵清蛋白霧化攻擊,每天每次 60 s。第 4 ～ 24 天 OVA 致敏+煙熏組,每天煙熏30 min。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級動(dòng)物房,自由飲用經(jīng)過凈化和消毒處理的動(dòng)物飲用水,使用經(jīng)過輻射滅菌的顆粒飼料。

1.3.3 觀察指標(biāo)

(1)咳嗽反應(yīng)測定

1.0 %卵清蛋白溶液霧化攻擊結(jié)束后第2 天,將豚鼠放入長、寬、高分別為40 cm×30 cm×25 cm 引咳箱,引咳箱左右2 個(gè)側(cè)面各有1 個(gè)直徑為2 cm 換氣口。用10-4mmol/L 辣椒素溶液引咳5 min,觀察10 min,以受試豚鼠出現(xiàn)伸出前腳、頸部伸向前、張口等明顯咳嗽反應(yīng),專業(yè)設(shè)備擴(kuò)音后豚鼠咳嗽出聲記為一次咳嗽,經(jīng)2 名受過培訓(xùn)的專業(yè)人員記錄首次咳嗽時(shí)間及10 min 咳嗽次數(shù)。

(2)氣道高反應(yīng)測定

采用RC 系統(tǒng),觀測豚鼠氣道阻力(RI)和肺順應(yīng)性(Cydn)變化。以戊巴比妥鈉麻醉受試豚鼠,行氣管插管后,測定基值5 min 并進(jìn)行Cydn 測定,之后以NS 及4 個(gè)劑量乙酰甲膽堿激發(fā),每次給藥量20 μL,順序?yàn)?NS、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 乙酰甲膽堿溶液進(jìn)行霧化激發(fā),每次霧化30 s,記錄4 min每次藥量下的RI 值。

(3)HE 染色及評分

受試豚鼠行肺功能測試后,立即摘除左肺,置固定液中保存;常規(guī)脫水,石蠟包埋,做4 μm 連續(xù)切片,烤片后放入蘇木精染料10 min 后蒸餾水流水沖洗1 min,伊紅染料10 min 后常規(guī)脫水封片,顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)并拍照。以Ashcroft 分級表進(jìn)行評分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后(α=0.05),以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,兩兩比較采用Turkey 法,以P＜0.05 認(rèn)為具有顯著性差異;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,以中位數(shù)(四分?jǐn)?shù)間距)(P50(Q))表示,采用非參數(shù)分析進(jìn)行組間比較,兩兩比較采用Dumn 法,以P＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠首次咳嗽時(shí)間及10 min 咳嗽次數(shù)

與空白對照組比較,OVA 致敏組的10 min 咳嗽次數(shù)明顯增多(P＜0.05),首次咳嗽時(shí)間明顯提前(P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OVA 致敏+煙熏組相對于空白對照組的首次咳嗽時(shí)間明顯提前(P＜0.01),咳嗽次數(shù)明顯增多(P＜0.01),具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。詳見表1,圖1、2。

表1 3 組豚鼠咳嗽癥狀比較ΔTable 1 Cough symptoms of guinea pigs in three groups

圖1 3 組豚鼠10 分鐘咳嗽次數(shù)比較Figure 1 Cough number in 10 minutes of guinea pig in three groups

圖2 3 組豚鼠首次咳嗽時(shí)間比較Figure 2 Cough latency in 10 minutes of guinea pig in three groups

2.2 豚鼠氣道高反應(yīng)

氣道高反應(yīng)性是哮喘最重要的病理特征,通常用于區(qū)別CVA 與其他氣道炎癥疾病。采用四個(gè)劑量乙酰甲膽堿霧化攻擊,測試空白對照組、OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組氣道阻力變化。結(jié)果顯示,在鹽水及第一個(gè)激發(fā)量(0.2 mg/mL)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組的 RI 無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。第二個(gè)激發(fā)量(0.4 mg/mL)激發(fā)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組RI明顯上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),OVA 致敏+煙熏組RI 無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在第三個(gè)激發(fā)量(0.6 mg/mL)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組(P＜0.01)、OVA 致敏+煙熏組(P＜0.05) RI 明顯上升。在第四個(gè)激發(fā)量(0.8 mg/mL)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組 RI 明顯上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。以 RC 系統(tǒng)測定實(shí)驗(yàn)豚鼠5 min Cydn 變化,與空白對照組相比,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組的 Cydn 明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。詳見圖3、4,表2、3。

2.3 豚鼠組織病理學(xué)

空白對照組粘膜上皮正常,管腔內(nèi)脫落細(xì)胞少,管壁及周圍平滑肌無增厚,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤較少;OVA 致敏組及OVA 致敏+煙熏組肺組織官腔內(nèi)脫落細(xì)胞多,管壁及周圍平滑肌增厚,嗜酸性粒細(xì)胞浸潤多,臨近血管壁增厚,肺泡間隔及肺組織破壞明顯。根據(jù)以前的研究[10],我們以Ashcroft 分級表對HE 染色涂片進(jìn)行評分,相較于空白對照組,OVA 致敏組(P＜0.01) 與 OVA 致敏+煙熏組(P＜0.01)評分均上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。詳見圖5、6,表4。

圖3 3 組豚鼠RI 值比較Figure 3 RI of guinea pig in three groups

圖4 3 組豚鼠Cydn 值比較Figure 4 Cydn of guinea pig in three groups

表2 3 組豚鼠 RI 值比較(±s)Table 2 RI of guinea pigs in three groups

表2 3 組豚鼠 RI 值比較(±s)Table 2 RI of guinea pigs in three groups

組別Groups NS 0.2 mg/mL 0.4 mg/mL 0.6 mg/mL 0.8 mg/mL空白對照組 Control group 0.38±0.07 0.39±0.07 0.39±0.07 0.41±0.07 0.46±0.06 OVA 致敏組 OVA group 0.37±0.07 0.47±0.09 0.76±0.37* 1.34±0.59** 2.21±0.28**OVA 致敏+煙熏組 OVA+CS group 0.35±0.08 0.38±0.09 0.44±0.09 1.02±0.63* 1.85±0.60**

表3 3 組豚鼠 cydn 值比較(±s)Table 3 Cydn of guinea pigs in three groups

表3 3 組豚鼠 cydn 值比較(±s)Table 3 Cydn of guinea pigs in three groups

注:與 Control 組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with Control group,*P＜0.05,**P＜0.01.

組別Groups 肺順應(yīng)性Cydn空白對照組Control group 0.47±0.10 OVA 致敏組 OVA group 0.32±0.06*OVA 致敏+煙熏組 OVA+CS group 0.30±0.05*

表4 3 組豚鼠Ashcroft 分級表計(jì)分比較(P50(Q))Table 4 Ashcroft score of guinea pigs in three groups

圖5 3 組豚鼠Ashcroft 分級表計(jì)分比較Figure 5 Ashcroft score of guinea pig in three groups

圖6 3 組豚鼠肺組織的病理學(xué)改變Figure 6 Histopathology of the lung tissues of guinea pigs in three groups

3 討論

咳嗽變異性哮喘(CVA)是常見的呼吸系統(tǒng)疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)有 50% ～80%兒童和 10% ～33%成人CVA 患者會(huì)發(fā)展成為典型哮喘,其也是慢性咳嗽的最主要病因之一[11-12]。咳嗽癥狀、肺功能實(shí)驗(yàn)以及肺組織病理學(xué)改變是診斷 CVA 的最主要依據(jù)[10,13]。CVA 豚鼠模型被廣泛應(yīng)用于咳嗽變異型哮喘的研究,且如何提高模型咳嗽敏感性、降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率、避免免疫反應(yīng)過度使得CVA 模型成為哮喘模型是造模的核心問題[14-15]。相關(guān)研究表明香煙煙霧會(huì)導(dǎo)致咳嗽敏感性增加,近些年來多位學(xué)者嘗試以煙熏的方式增加模型動(dòng)物的咳嗽敏感性[16-17]。同時(shí),卵清蛋白致敏法是最為經(jīng)典的CVA造模方法,造模過程主要分為 OVA 腹腔注射及OVA 霧化攻擊兩階段,不同實(shí)驗(yàn)組在OVA 使用濃度上存在較大差異,在OVA 腹腔注射階段OVA 濃度大多在0.1%～10.0%,在霧化攻擊階段OVA 濃度大多在1.0%～5.0%,致敏所用的OVA 在產(chǎn)家、批次、純度上差異可能是導(dǎo)致其濃度不同的關(guān)鍵因素[18-20]。相關(guān)研究表明適量減少OVA 用量可以提高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)定性,避免免疫反應(yīng)過度[21]。

基于以上的論述,本課題組提出以O(shè)VA 致敏聯(lián)合煙熏的方法制備一批咳嗽變異型哮喘豚鼠模型,并通過測定咳嗽反應(yīng)、肺功能、評價(jià)肺組織病理學(xué)改變?nèi)N方法評估此動(dòng)物模型。本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),以2.0% OVA 溶液腹腔注射,以10.0%、5.0% OVA 溶液霧化攻擊的受試豚鼠,在造模及氣道高反應(yīng)測定階段時(shí)均易產(chǎn)生免疫過度反應(yīng),且死亡率也較高,而當(dāng)OVA 溶液腹腔注射濃度降低到0.2%、OVA 溶液霧化攻擊濃度較低到1.0%時(shí),受試豚鼠死亡率明顯降低且表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的高氣道反應(yīng)。故在正式實(shí)驗(yàn)中,本課題組選用 0.2%OVA 溶液腹腔注射,1.0%濃度OVA 溶液霧化攻擊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空白對照組相比,OVA 致敏組(P＜0.05)、OVA 致敏+煙熏組(P＜0.01)咳嗽次數(shù)顯著上升,首次咳嗽時(shí)間明顯提前,且OVA 致敏+煙熏組(P＜0.01)更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明OVA 致敏及OVA 致敏聯(lián)合煙熏這兩種方法均導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咳嗽反應(yīng)增強(qiáng),而OVA 致敏聯(lián)合煙熏相較于單獨(dú)使用OVA 致敏咳嗽反應(yīng)增強(qiáng)更加明顯。本實(shí)驗(yàn)組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),1.6 mg/mL 乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)豚鼠死亡率較高,而在0.6 mg/mL 時(shí)部分豚鼠RI 已有顯著提升,故在正式實(shí)驗(yàn)中以0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 四個(gè)劑量乙酰甲膽堿激發(fā)。結(jié)果顯示,在NS 及第一個(gè)激發(fā)劑量(0.2 mg/mL)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組的RI 無明顯上升。在后三個(gè)劑量激發(fā)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏組RI 明顯上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.4 mg/mLP＜ 0.05,0.6 mg/mLP＜ 0.01,0.8 mg/mLP＜0.01)。直到第三個(gè)劑量激發(fā)時(shí),與空白對照組相比,OVA 致敏+煙熏組RI 開始明顯上升,具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 差 異 (0.6 mg/mLP＜ 0.05,0.8 mg/mLP＜0.01)。這符合臨床及相關(guān)實(shí)驗(yàn)中氣道激發(fā)試驗(yàn)時(shí),小劑量乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)RI 上升較少,而增大乙酰甲膽堿激發(fā)量時(shí)RI 顯著上升的特點(diǎn)[22-23]。這表明相較于空白對照組,OVA 致敏組與OVA 致敏+煙熏組氣道均呈高反應(yīng)性。值得一提的是,相較于OVA 致敏組,OVA 致敏+煙熏組RI 上升更加平緩,這與CVA 患者的氣道高反應(yīng)性比典型哮喘略低,是典型哮喘的先導(dǎo)階段這一特征相符合[24]。同時(shí),相較于空白對照組,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組Cydn 均明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在組織病理學(xué)方面,相較于空白對照組,OVA 致敏組、OVA 致敏+煙熏組肺組織病理變化更符合咳嗽變異型哮喘肺部病理特征且Ashcroft 分級表計(jì)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。因此我們得出結(jié)論相較于空白對照組,OVA 致敏組與OVA 致敏+煙熏組在咳嗽反應(yīng)、肺功能測定、肺組織病理學(xué)三方面均符合咳嗽變異型哮喘特征。更重要的是,相較于OVA 致敏組,OVA 致敏+煙熏組咳嗽次數(shù)顯著上升、首次咳嗽時(shí)間明顯提前、RI 上升更加平緩,這些結(jié)果表明OVA 致敏+煙熏組有更好的咳嗽敏感性且更加符合咳嗽變異型哮喘氣道高反應(yīng)性較典型哮喘略低這一重要特征。

在此前的研究中,高明等[9]研究人員已為卵清蛋白致敏聯(lián)合煙熏建立咳嗽變異型哮喘豚鼠模型打下良好的基礎(chǔ),值得我輩借鑒。但此模型在低濃度乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)RI 值明顯增加,高濃度時(shí)RI值不增反降,與Saito 等[25]的研究結(jié)果有一定的差異,而在本次實(shí)驗(yàn)中,CVA 豚鼠模型取得了較好的RI 表現(xiàn),即小劑量乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)RI 上升較少,而增大乙酰甲膽堿激發(fā)量時(shí)RI 顯著上升。OVA 致敏豚鼠模型是最經(jīng)典的動(dòng)物哮喘模型,但因豚鼠個(gè)體差異較大,經(jīng)常出現(xiàn)受試動(dòng)物過度反應(yīng)死亡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[26]。Jiao 等[8]提出以免疫抑制劑聯(lián)合OVA 來避免這種過度反應(yīng)現(xiàn)象,由此看出對于OVA的過度反應(yīng)是OVA 致敏豚鼠模型普遍難題。而適量減低OVA 濃度似乎可以在一定程度上減輕這種過度反應(yīng)現(xiàn)象。由此我們推測此次CVA 豚鼠模型取得較好的RI 表現(xiàn),可能與本實(shí)驗(yàn)組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中排除了2.0%～10.0% OVA 致敏濃度,選擇以0.2%OVA 溶液腹腔注射、以1.0% OVA 溶液霧化攻擊密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示:OVA 致敏聯(lián)合煙熏的咳嗽變異型哮喘豚鼠模型在咳嗽反應(yīng)、肺功能測定、肺組織病理學(xué)三方面均符合咳嗽變異型哮喘特征。同時(shí),相較于單純使用OVA 致敏,OVA 致敏聯(lián)合煙熏造模在咳嗽反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性方面表現(xiàn)更好,更符合咳嗽變異性哮喘的臨床特點(diǎn)。一方面在特定實(shí)驗(yàn)條件下,降低OVA 致敏濃度是本模型成功與否的關(guān)鍵,由于在既往文獻(xiàn)中對于致敏OVA 的廠家、貨號(hào)、純度等信息不夠重視,為復(fù)制模型造成了一定困難,故在先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中確定固定廠家、固定貨號(hào)、固定純度的OVA 最適當(dāng)?shù)闹旅魸舛仁侵刂兄亍Ａ硪环矫?煙熏提高咳嗽敏感性也是造模成功的重要因素,但為何OVA 致敏在聯(lián)合煙熏后氣道阻力不升反降,是否煙熏對氣道阻力有一定的積極影響這一問題仍待后續(xù)研究[27]。