三種術式大鼠肝外型膽汁淤積模型的對比研究

王思宇張迎紅劉林秀魯仁財何 宏王紹波*

(1.昆明醫科大學,昆明 650500; 2.云南省第一人民醫院PET-CT 中心,昆明 650100;3.云南省第一人民醫院病理科,昆明 650100)

膽汁淤積性疾病(cholestatic disease,CD)是人類常見的肝膽疾病之一。導致CD 的原因有很多,大致分肝外型及肝內型。肝內型CD 又分為肝細胞型及肝內膽管型[1],該類動物模型大多由藥物誘導[2-5],造模方式較為成熟,成功率也較高。肝外型大多以手術結扎膽管的方式[6-7],主要術式包括傳統法(膽總管結扎法)、改良法(肝門區肝總管縫扎法)及電刀法(膽總管高頻電刀電凝法)。

目前,三種術式制作大鼠CD 模型效果的對比研究尚不充分,本研究擬綜合分析血清學、影像學及病理學變化,評價三種術式CD 模型的優缺點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

15 只 1 月齡的 SPF 級雌性 SD 大鼠,體重 190 ～210 g,均購自昆明醫科大學實驗動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]。飼養條件為溫度20℃ ～25℃,濕度40%左右,12 h 光照12 h 黑暗交替,自由飲食和飲水。所有大鼠適應正常飲食2 周后,隨機分為3 組進行手術造模,分別為傳統組(膽總管結扎法,n=5)、改良組(肝門區肝總管縫扎法,n=5)及電刀組(膽總管電凝法,n=5)。飼養及手術場地、設備均由昆明醫科大學實驗動物中心提供[SYXK(滇)K2015-0002]。本研究由昆明醫科大學實驗動物管理委員會批準(KMMU2020008),所有操作均符合動物倫理學要求,并遵循實驗動物3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

麻醉藥品為速眠新Ⅱ(長沙拜特生物科技研究所有限公司,批準文號:獸藥字180121777),規格為每支2 mL;抗生素為獸用硫酸慶大霉素注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司,批準文號:獸藥字(2016)040191504),每支2 mL;手術器械均購于新華手術器械有限公司;獸用高頻電刀(合肥金腦人光電儀器有限責任公司,型號為DK-A);小動物手術臺(南昌市山力畜牧器械有限公司);恒溫動物飼養箱(北京福意聯醫療設備有限公司);CT 掃描儀為Philips Ingenuity TF PET/CT 64 排螺旋 CT,配備有Philips IntelliSpace Portal v7.0.4.20175 圖像后處理工作站。

1.3 實驗方法

1.3.1 手術準備

15 只大鼠術前禁飲禁食12 h,麻醉均使用速眠新Ⅱ每只0.1 mL 肌肉注射進行麻醉,約10 min 左右大鼠進入麻醉狀態,常規術前行CT 掃描;迅速腹部及背部備皮,0.9% NaCl 溶液沾濕背部皮膚,置于小動物手術臺,固定四肢,背部放置高頻電刀負極板,連接好電刀負極板、正極單極電刀及腳控板。

1.3.2 造模方法

常規消毒鋪巾,取劍突下腹正中縱切口,切口長度為3 cm,切開皮膚暴露皮下結締組織及肌層,小彎鉗輕提起切口兩邊皮膚,中彎鉗鈍性分離皮下疏松結締組織,使皮膚及肌層分離;蚊式鉗輕提起肌肉,組織剪剪開肌層進入腹腔,尋找十二指腸大乳頭及膽總管,游離膽總管及肝門區肝總管。

傳統手術組(Conventional group)(n=5):將游離出的膽總管的近端及遠端雙重縫線結扎,檢查有無膽漏及活動性出血。

改良手術組(Modified group)(n=5):將游離出的肝門區肝總管進肝門處縫線結扎,檢查有無膽漏及活動性出血。

電刀手術組(Electrocoagulation group)(n=5):蚊式鉗輕夾起膽總管,遠離周圍組織,單極電刀電凝模式,功率20 w 輕觸碰蚊式鉗約1～2 s,觀察到觸碰到蚊式鉗的膽總管稍變白,檢查有無膽漏及活動性出血。

確認無膽漏及活動性出血后,逐層連續縫合法關腹,放置于恒溫箱內等待蘇醒;每只大鼠結束手術后均肌肉注射0.3 mL 硫酸慶大霉素注射液,連續給藥3 d;所有大鼠造模后繼續飼養7 d,7 d 之內飲食、濕度、溫度及光照等飼養條件同術前。

1.3.3 CT 掃描方法

在大鼠手術造模第7 天時在速眠新II 麻醉下稱重后進行CT 掃描,掃描方案及重建參數:管電壓:140 KV,管電流:300 mAs,螺距:0.329,FOV:100 mm,矩陣:1024;重建方案為:層厚:0.67 mm,層距:0.67 mm,重 建 模 式: Standard,Filter: Y-Sharp ( YC ),Enhancement:0.00,Windowing:C75,W325。所有圖像傳輸至Philips IntelliSpace Portal 工作站,手動測量擴張膽管直徑;于肝實質內手動勾畫圓形ROI 以測量肝CT 值均值,勾畫ROI 時,避開大血管及擴張膽管。

1.3.4 血清學檢查

掃描結束后采用斷尾采血,接肝素鋰抗凝管采血管,待收集約3 mL 全血后停止收集;所有采血管放入低速離心機,3500 r/min 15 min 后,巴氏吸管收集上層血漿,裝入EP 反應管,所有血漿2℃～8℃保存,等待送至昆明金域醫學檢驗所,采用ELISA 法測量 AST、ALT、TBIL、DBIL。

1.3.5 病理學檢查

所有大鼠采血結束后統一麻醉過量法處死,取肝三角葉采用4.2%～5.2%福爾馬林自封袋固定約48 h,送至云南省第一人民醫院病理科進行石蠟切片HE 染色。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0 統計軟件包進行統計分析,采用Graphpad 8.3 繪制圖形,符合正態分布的計量資料用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差(One-way ANOVA)分析;進一步兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

所有3 組大鼠造模手術操作均成功(圖1);傳統組大鼠活動減少,皮毛變暗、變黃,尿液呈金黃色,糞便顏色明顯變淺,術后第3 天發現傳統組大鼠死亡1 只。一只傳統組大鼠手術切口可見淡黃色滲液漏出;其余兩組之間大鼠行為及狀態無明顯差異,糞便顏色稍變淺;術后第7 天處死后3 組動物均未見膽漏發生。

2.2 血清學表現

肉眼觀察到傳統組血漿顏色較其他兩組明顯變黃。3 組大鼠 AST、ALT 均上升,以傳統組最為明顯;傳統組較電刀組 AST、TBIL、DBIL 高,差異有統計學差異(P＜0.05),兩組ALT 無統計學差異(P＞0.05);傳統組較改良組 AST、ALT、TBIL、DBIL高,差異有統計學差異(P＜0.05),且 ALT 差異明顯(P＜0.01);改良組及電刀組 AST、ALT、TBIL、DBIL 之間比較均無統計學差異(P＞0.05)。(表1、圖2)

圖1 三種術式大鼠膽汁淤積模型造模方法Figure 1 Three surgical methods for modeling cholestasis model in rats

表1 三種大鼠手術膽汁淤積模型血清學指標比較( ±s)Table 1 Comparison of serology of three models of cholestasis in rats

表1 三種大鼠手術膽汁淤積模型血清學指標比較( ±s)Table 1 Comparison of serology of three models of cholestasis in rats

注:與傳統組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with conventional group,*P＜0.05,**P＜0.01.

組別Groups n AST(U/L) ALT(U/L) TBIL(μmol/L) DBIL(μmol/L)傳統組 Conventional group 4 796.3±223.4 223.0±21.8 155.2±27.1 137.0±20.0改良組 Modified group 5 224.2±33.4* 60.2±9.2** 4.2±3.1* 2.1±1.7*電刀組 Electrocoagulation group 5 297.6±157.7* 195.8±172.1 4.4±3.1* 3.1±1.6*

圖2 三種術式大鼠膽汁淤積模型造模第7 天血清學指標情況Figure 2 Serological status of three surgical models of cholestasis in rats at 7 days after surgery

2.3 病理學表現

傳統組大鼠在取肝組織樣本可發現膽管擴張明顯(圖3),其余兩組大鼠肉眼可見膽管輕度擴張,但不明顯。

病理切片可見傳統組在三組中膽管增生、膽管壁增厚程度最嚴重,改良組程度最輕,電刀組居于兩者之間(圖4)。

2.4 影像學表現

術前掃描所有大鼠膽管均未見顯示。術后7 d CT 平掃可見所有大鼠肝外膽管均擴張,3 組膽管內徑比較有統計學差異(P＜0.05),進一步兩兩比較顯示,傳統組擴張膽管內徑均大于改良組和電刀組(P＜0.05),改良組及電刀組兩組之間膽管直徑無統計學差異(P＞0.05)。

術前3 組大鼠之間肝CT 值比較無統計學差異(P＞0.05)。術后7 d 肉眼可見傳統組肝密度下降,傳統組肝CT 值與術前比較明顯減低(P＜0.01),改良組和電刀組肝CT 值較術前均無統計學差異(P＞0.05)(表2、圖5)。

圖3 傳統組大鼠肝樣本取材Figure 3 Liver samples were taken from the conventional group

圖4 三種術式大鼠膽汁淤積造模第7 天的肝組織病理改變Figure 4 The pathological changes in liver of three surgical models of cholestasis in rats at 7 days after surgery

圖5 三種術式膽汁淤積模型造模第7 天的CT 表現Figure 5 The CT findings of three surgical models of cholestasis in rats at 7 days after surgery

表2 三種大鼠膽汁淤積模型肝外膽管擴張情況及肝CT 值變化比較( ±s)Table 2 Comparison of extrahepatic choledochal dilatation and CT value of liver in three models of cholestasis in rats

表2 三種大鼠膽汁淤積模型肝外膽管擴張情況及肝CT 值變化比較( ±s)Table 2 Comparison of extrahepatic choledochal dilatation and CT value of liver in three models of cholestasis in rats

注:與傳統組比較,*P＜0.05;與改良組比較,#P＞0.05。Note.Compared with conventional group,*P＜0.05.Compared with modified group,#P＞0.05.

組別Groups n肝外膽管內徑(mm)Diameter of extrahepatic bile duct肝 CT 值(Hu)Liver CT Value 0 d 7 d t P傳統組Conventional group 4 9.7±1.7 75.9±2.1 61.7±3.6 5.181 0.014改良組Modified group 5 2.5±1.4* 76.5±2.8 75.2±2.0 -1.562 0.193電刀組Electrocoagulation group 5 4.2±0.8*# 75.5±4.8 75.2±5.5 -0.852 0.442

3 討論

大鼠是動物實驗常用的動物之一,常被用于各種研究[8]以及人類疾病模型的建立[9];由于物種的差異與相似性,是否能最大程度上模擬人類各種疾病的病程變化成為評價一個動物模型的重要因素之一。

人類肝外膽汁淤積疾病大多以肝外膽道發生狹窄所致,大致分為以下幾個病因:①炎癥性狹窄[10-11](化膿性膽管炎、硬化性膽管炎、急性膽囊炎、十二指腸憩室炎、寄生蟲等);②創傷性狹窄[12-13](外傷性膽道狹窄、膽道手術損傷、吻合口狹窄、T 管放置不當致狹窄、肝移植后膽管狹窄等);③膽管結石(原發性、繼發性);④外壓性狹窄(慢性胰腺炎、周圍占位性病變致膽道狹窄);⑤先天性狹窄(先天性膽道閉鎖、膽總管囊腫合并膽管狹窄);⑥腫瘤性狹窄[14](膽管上皮細胞腫瘤、膽管間皮細胞腫瘤、膽管細胞癌等)。

三種膽汁淤積術式造模方式成功率都很高;傳統組術式手術難度適中,需要徹底游離膽總管,對于部分剛剛接觸動物手術的人來說,可能會游離過程可能會損傷周圍的血管甚至膽管;改良組需要花費很多時間尋找到肝門區肝總管,筆者初次嘗試后感覺該術式較為復雜,大批量的造模對于術者是個考驗;電刀組術式較為簡單,對于周圍組織損傷小,但是電凝時間和膽管狹窄程度有關,需要術者不斷練習,才能保證各模型鼠之間狹窄程度近似。

本研究中傳統組一只大鼠手術切口可見淡黃色滲液漏出,術后第7 天處死動物后,各組造模大鼠均未出現膽漏情況,我們推測該大鼠滲出的淡黃色液體可能是含有大量膽紅素的腹水。膽漏是電凝膽總管造模較為常見的并發癥,筆者結合文獻[15]和對該電凝造模如何避免膽漏的發生進行了如下總結:①電刀的檔位:電刀一定要選在電凝檔位,電切檔位雖然也可以造成膽管的損傷,但是由于兩個檔位輸出的能量頻率不同,電切檔位很容易造成膽漏。②功率的選擇:筆者使用的功率為20 W,效果較為穩定,功率過大可能直接導致膽漏甚至膽管斷裂。③控制電凝時間:筆者認為電凝1～2 s 最佳,時間較短會造成電凝不充分,延長造模時間;時間過長則可能引起膽漏。④適當增加電刀與膽管的接觸面積:筆者在進行造模時,使用了蚊式鉗進行電熱傳導,增大了膽管與電刀之間的受熱面積,增加了時間上的容錯率;根據術者習慣也可以選擇面積較大的電刀刀頭。

對比三種術式大鼠膽汁淤積模型可以看出傳統組在一周左右出現了血清學肝酶明顯上升、膽紅素明顯升高、肝CT 值下降等一系列肝功能受損的表現,傳統組在三組之中影像學及病理學檢查膽管擴張也是最嚴重的,與其余兩組比較有統計學差異(P＜0.05);在術后由于該組1 只大鼠死亡,印證了大多數文獻報道該方法死亡率較高,安全性較低,不利于大鼠長期的實驗研究,死亡的大鼠也浪費了實驗的時間成本及資金成本[16-18]。其余兩組相對較為安全,也能有效的延長膽汁淤積病程;改良組能模擬疾病較為固定,能模擬人一側肝管慢性炎性狹窄及腫瘤生長所導致的膽汁淤積,造成的肝損傷及膽汁淤積也是三組中最弱的(表1、表2),并且個體之間差異小,但是造模周期較其余兩組長,且肝葉之間會產生差異;電刀組對于模擬人膽管慢性炎性狹窄及腫瘤所致狹窄要優于傳統組,由于損傷的為膽總管,所以各肝葉病理變化基本一致,但是造模后各指標因術者對于膽管電熱損傷不同而產生差異,導致造模后血清學變化個體差異較大(表1),但是影像學上膽管直徑個體差異小(表2)。

本研究相對于其他手術造模研究來說,最大的優點在于引入了影像學,可以更加直觀的觀察到各組之間肝密度及膽管擴張程度,也為之后造模后進一步實驗提供了無創的監測方法;本研究不足之處在于沒有采用影像的方式動態的監測肝及膽管的變化,作為無創檢查,優點在于可重復性,動態的監測三種術式的影像變化會使得本研究更加直觀、全面。

綜上所述,傳統組(膽總管結扎)適用于模擬人膽管急性狹窄,且短期內會造成影像學肝損傷及膽汁淤積表現,不適用于慢性膽管狹窄的研究;改良組(肝總管縫扎)造模穩定,個體差異小,適用于模擬人一側肝管的急性狹窄,有效的延長了病程,但是肝葉之間差異較大;電刀組(膽總管電凝)作為傳統法的改良,既能延長膽汁淤積病程,有利于動態觀察病程發展,又能保持肝葉之間病理變化的一致性,病程發展也更類似于人膽管慢性狹窄。

總體上,本研究較為全面和系統分析和對比了三種膽汁淤積造模術式的優缺點,有助于膽汁淤積相關診斷和治療研究選擇合適的動物建模方法。