轉(zhuǎn)錄因子YY1上調(diào)PD-L1表達(dá)促進(jìn)膽囊癌免疫逃逸的作用研究

周 杰李敬東權(quán) 剛孫 驥

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科/川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所,四川南充 637000)

膽囊癌是發(fā)生于膽囊的惡性腫瘤,發(fā)病率位居消化道系統(tǒng)腫瘤的第6 位,在中國發(fā)病率為(1.00 ～1.30)/10 萬,其惡性程度高,預(yù)后差[1-2]。最近研究表明,在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中,人體免疫系統(tǒng)表現(xiàn)乏力,免疫細(xì)胞無法識(shí)別腫瘤細(xì)胞,此外腫瘤細(xì)胞還可分泌免疫抑制因子以破壞人體免疫系統(tǒng)[3-4]。因此,近幾年探究腫瘤細(xì)胞如何逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視成為研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子陰陽1(Yin-Yang1,YY1)可作為核轉(zhuǎn)錄因子廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞中,是多梳(polycomb group,PcG)蛋白家族的一員,參與細(xì)胞組織分化、染色質(zhì)重塑、腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[5-6]。程序性死亡分子配體 1(programmed death ligand 1,PD-L1)又稱為CD274,在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)且與其免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),在膽囊癌組織中PD-L1 高表達(dá),是影響膽囊癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9]。在膽囊癌中,PD-L1在免疫逃逸中發(fā)揮何種作用及調(diào)控機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道,PROMO 網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示,YY1 序列 3’UTR 區(qū)存在3 個(gè)PD-L1 結(jié)合位點(diǎn),說明PD-L1 是YY1 的靶基因。因此本研究構(gòu)建 YY1 siRNA-1675 轉(zhuǎn)染的GBC-SD 細(xì)胞進(jìn)行研究,以期探究YY1 和PD-L1 在膽囊癌免疫逃逸的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組織

隨機(jī)選取2017 年7 月-2019 年10 月在本院確診并行膽囊切除術(shù)的膽囊癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)癌旁膽囊組織標(biāo)本各40 例,所選患者在術(shù)前均未接受治療,臨床資料保存完整,患者已簽署知情同意書。另隨機(jī)選取同期因患膽囊結(jié)石患者行膽囊切除術(shù)的正常膽囊組織標(biāo)本20 例,患者已簽署知情同意書。組織切除后,迅速將組織置于4%中性甲醛溶液中保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人膽囊永生化上皮細(xì)胞系HGBEC 和人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD、SGC-996、IH-GB1 均購自中科院上海細(xì)胞庫;人T 淋巴細(xì)胞購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)分別:12100、F8250;細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào):RG129M;QuantiFast SYBR? Green PCR Kit 試劑盒購自德國QIANGE 公司,批號(hào):MA-1547;EasySep Human T cell Enrichment 試劑盒購自北京諾為生物技術(shù)有限公司,批號(hào):Q0412;白細(xì)胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)ELISA試劑盒均購自帝肯(上海)貿(mào)易有限公司,批號(hào)分別: BE53021、BE53041、BE51001; 干 擾 素 γ(interferon-gamma,IFN-γ)ELISA 試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司,批號(hào):R-783;質(zhì)粒載體PGPU6/GFP/Neo 購自上海吉?jiǎng)P化學(xué)公司,批號(hào):190416 L;螢火蟲熒光素酶(FLUC)檢測(cè)試劑盒購自美國 GeneCopoeia 公司,批號(hào):SF-1322。DM6M 光學(xué)顯微鏡購自德國徠卡公司;Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司;Mastercycler nexus X2 PCR 儀購自德國艾本德公司;CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。YY1 siRNA-1675 序列為 5’-GGGAGCAGAAGCAGGTGC AGT-3’、YY1 siRNA-NC 序列為 5’-AGGGCGAAC GGGCGAGTGG-3’,由廣州瑞博生物公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞系和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)液由 10% FBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 U/mL 青霉素、80% DMEM 培養(yǎng)液組成,常規(guī)培養(yǎng)在相對(duì)濕度98%、5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。隔天換液,光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,胰酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HGBEC 細(xì)胞、GBC-SD、SGC-996、IH-GB1 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GBC-SD 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升2×104個(gè),接種至24 孔培養(yǎng)板上,待GBC-SD 細(xì)胞平鋪占培養(yǎng)板底部約50%時(shí),采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法,按照Lipo fectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,轉(zhuǎn)染試劑:質(zhì)粒=3 μL:1 μg 比例配置質(zhì)粒粒-質(zhì)粒體復(fù)合物,將 YY1 siRNA-1675、YY1 siRNA-NC(YY1 siRNA無關(guān)序列)、空白質(zhì)粒(BC 組)轉(zhuǎn)染至GBC-SD 細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染24 h 后棄舊培養(yǎng)液,更換DMEM 常規(guī)培養(yǎng)液,置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。qRT-PCR 法測(cè)定各細(xì)胞中YY1 mRNA 水平,繼續(xù)培養(yǎng)用作實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為:1)BC 組;2)YY1 siRNA-NC 組;3)YY1 siRNA-1675 組。

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)各組織中YY1 表達(dá)

制備常規(guī)石蠟切片,進(jìn)行脫蠟、水化處理,加入Anti-YY1 抗體(1 ∶100),4℃ 孵育過夜,次日 PBS 清洗后,加入二抗(1 ∶2500),37℃孵育 1 h,加鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶溶液,37℃孵育40 min 后,進(jìn)行DAB 顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、透明處理,最后用中性樹膠封片。每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野(×200)觀察分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):(1)按細(xì)胞染色:未染色為0 分,淺黃色為1 分,棕黃色為2 分,棕褐色為3分;(2)按陽性細(xì)胞比例:≤10% 1 分,11%～50% 2分,51%～75% 3 分,＞75% 4 分,最終得分=染色得分×陽性細(xì)胞比例得分;≤3 分,為陰性或弱陽性,記作“-”;＞3 分,為陽性,記作“+”。

1.3.3 qRT-PCR 法測(cè)定各細(xì)胞中YY1 水平

用200 μL 細(xì)胞裂解液裂解培養(yǎng)板中各細(xì)胞,離心后取上清液,行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄體系:RNase-free dH2O 5 μL、Total RNA 2 μL、5X gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL,逆轉(zhuǎn)錄得 cDNA,以 cDNA作為擴(kuò)增模板用于qRT-PCR 擴(kuò)增。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。YY1 上游引物序列 5’-CCAGAAAACACAAATT-3’,下游引物序列5’-AAAGAAGAGAGAAAAGAGGTT-3’;GAPDH 上游引物序列 5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’,下游 引物 序列 5’-CCATGTAGTTGAGGTCAAT GAAG-3’。擴(kuò)增體系:反向引物 2 μL、正向引物 2 μL、RNase-free dH2O 4 μL、2X QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 2 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5 min,(95℃ 10 s、60℃ 34 s、68℃30 s)×38 個(gè)循環(huán),72℃延伸 10 min。每個(gè)樣本重復(fù)6 次。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算 YY1 相對(duì) GAPDH mRNA表達(dá)量。

1.3.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定 PD-L1、CD69、CD25 水平

各組GBC-SD 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×105個(gè),接種至anti-CD3 預(yù)包被的96 孔板中,隨后加入人T 淋巴細(xì)胞,兩者按GBC-SD:T(1 ∶5)的效靶比混合,常規(guī)培養(yǎng)3 d 后,用 EasySep Human T cell Enrichment 試劑盒收集T 淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定GBC-SD 細(xì)胞PDL1 水平、T 淋巴細(xì)胞 CD69、CD25 水平。

1.3.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定人T 淋巴細(xì)胞凋亡率

各組GBC-SD 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,用DMEM 培養(yǎng)調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升2×105個(gè),接種至 anti-CD3 預(yù)包被的24 孔板中,隨后加入人T 淋巴細(xì)胞,兩者按GBC-SD:T(1 ∶5)的效靶比混合,常規(guī)培養(yǎng)3 d,收集人T 淋巴細(xì)胞,預(yù)冷的乙醇固定20 min,離心,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè),加入 PI 和AnnexinV-FITC,避光上樣,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6 ELISA 檢測(cè) IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平

按照“1.3.5”所述培養(yǎng)細(xì)胞,取上清液,用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平,操作按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證YY1 與PD-L1 靶標(biāo)關(guān)系

(1)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)及突變載體制備

使用PROMO 網(wǎng)站預(yù)測(cè)YY1 的潛在靶基因,構(gòu)建PD-L1 3’UTR 區(qū)域含有結(jié)合位點(diǎn)及突變的序列pMIR-Report-PD-L1-3’UTR 質(zhì)粒,行雙酶切后與同樣行雙酶切的 pmirGLO 載體連接,構(gòu)建野生pmirGLO-PD-L1-3’UTR-WT(PD-L1-WT)驗(yàn)證載體及突變型 pmirGLO-PD-L1 - 3’ UTR-Del1-MUT +YY1siRNA-1675 ( PD-L1-Del1-MUT + YY1 siRNA-1675),PD-L1-Del2-MUT+YY1 siRNA-1675,PD-L1-Del3-MUT+YY1 siRNA-1675,PD-L1-Del1、2、3-MUT+YY1 siRNA-1675 組驗(yàn)證載體及對(duì)照組PD-L1-WT+YY1 siRNA-1675。

(2)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將YY1 siRNA-1675 分別與上述構(gòu)建的載體共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h 后,加入螢火蟲熒光素酶(FLUC)檢測(cè)試劑,15 min 后測(cè)定FLUC 活性值F,隨后加入海腎熒光素酶(RLUC)檢測(cè)試劑,10 min 后測(cè)定RLUC活性值R,熒光素酶相對(duì)活性用R/F 比值表示,每組實(shí)驗(yàn)平行6 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,n表示樣本數(shù),多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用%表示,行卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同膽囊組織中YY1 表達(dá)水平比較

YY1 蛋白主要定位于細(xì)胞核,陽性細(xì)胞呈棕黃色,與正常組織相比,癌旁組織、膽囊癌組織中YY1陽性表達(dá)率顯著升高(P＜0.05),與癌旁組織相比,膽囊癌組織中YY1 蛋白陽性表達(dá)率顯著升高(P＜0.05)。見圖1、表1。

2.2 各細(xì)胞中YY1 水平比較

收集人膽囊癌 IH-GB1、SGC-996、GBC-SD 細(xì)胞和人膽囊上皮HGBEC 細(xì)胞,檢測(cè) YY1mRNA 水平表達(dá),qRT-PCR 結(jié)果顯示 YY1 在 IH-GB1、SGC-996、GBC-SD 細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.12、1.62±0.13、1.97±0.15,顯著高于在 HGBEC 細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量 1.03±0.11(P＜0.05),見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞YY1 水平比較

轉(zhuǎn)染siRNA-1675 24 h 后,置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,YY1 siRNA-NC 組和YY1 siRNA-1675組均已成功轉(zhuǎn)染且轉(zhuǎn)染效率較高,42 h 后收集細(xì)胞,提取RNA,qRT-PCR 結(jié)果顯示,YY1 siRNA-1675組YY1 相對(duì)表達(dá)量為1.37±0.11 顯著低于BC 組和YY1 siRNA-NC 組 YY1 相對(duì)表達(dá)量為1.96±0.14,1.92±0.16(P＜0.05),見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞PD-L1 水平比較

轉(zhuǎn)染siRNA-1675,42 h 后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定 GBC-SD 細(xì)胞 PD-L1 水平,siRNA-1675 組PD-L1 表達(dá)為(20.17±3.16)%,顯著低于 BC 組和YY1 siRNA-NC 組 PD-L1 表 達(dá) 量 為 (34.18 ±5.21)%,(32.30±5.87)%(P＜0.05),見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞對(duì)人T 淋巴細(xì)胞凋亡率的影響

轉(zhuǎn)染siRNA-1675,42 h 后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定人T 淋巴細(xì)胞凋亡率,BC 組細(xì)胞凋亡率為(16.7±1.8)%,YY1 siRNA-NC 組細(xì)胞凋亡率為(17.2±1.9)%,YY1 siRNA-1675 組細(xì)胞凋亡率為(8.0±1.2)%,與 BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組人T 淋巴細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05),見圖5。

2.6 轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞對(duì)人T 淋巴細(xì)胞CD69、CD25 水平的影響

轉(zhuǎn)染siRNA-1675,42 h 后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定 T 淋巴細(xì)胞 CD69、CD25 水平,BC 組 T 淋巴細(xì)胞 CD69、CD25 水平為(64.21±8.37)%、(48.51±5.94)%,YY1 siRNA-NC 組 T 淋巴細(xì)胞 CD69、CD25水平為(68.64±7.95)%、(50.48±6.50)%,YY1 siRNA-1675 組 T 淋巴細(xì)胞 CD69、CD25 水平為(89.36±10.48)%、(68.87±5.85)%,與 BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組 T 淋巴細(xì)胞CD69、CD25 水平明顯升高(P＜0.05),見圖6。

圖1 不同膽囊組織中YY1 蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色)Figure 1 Expression of YY1 protein in different gallbladder tissues (Immunohistochemical staining)

表1 不同膽囊組織中YY1 表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of YY1 expression levels in different gallbladder tissues

2.7 各組細(xì)胞上清液中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平比較

轉(zhuǎn)染siRNA-1675,42 h 后收集細(xì)胞,取上清液,用ELISA 測(cè)定 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平,與 BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平顯著升高(P＜0.05);BC 組和 YY1 siRNA-NC 組細(xì)胞上清液中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表2。

2.8 YY1 與 PD-L1 靶標(biāo)關(guān)系

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與PD-L1-WT 組比,PD-L1-WT+YY1 siRNA-1675 組熒光素酶相對(duì)活性明顯降低(P＜0.05);與 PD-L1-WT+YY1 siRNA-1675 組比,PD-L1-Del1-MUT+YY1 siRNA-1675 組、PD-L1-Del2-MUT+YY1 siRNA-1675 組、PD-L1-Del3-MUT+YY1 siRNA-1675 組、PD-L1-Del1、2、3-MUT+YY1 siRNA-1675 組熒光素酶相對(duì)活性顯著升高(P＜0.05),說明 PD-L1 是 YY1 的作用靶點(diǎn)。見圖7。

圖5 轉(zhuǎn)染后GBC-SD 細(xì)胞對(duì)人T 淋巴細(xì)胞凋亡率的影響Figure 5 Effect of GBC-SD cells on human T lymphocyte apoptosis rate after transfection

圖7 熒光素酶的相對(duì)活性Figure 7 Relative activity of luciferase

表2 各組細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平比較( ±s,n=6)Table 2 Comparison of IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ levels in cell supernatants of each group

表2 各組細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平比較( ±s,n=6)Table 2 Comparison of IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ levels in cell supernatants of each group

注:與 BC 組相比,aP＜0.05;與 YY1 siRNA-NC 組相比,bP＜0.05。Note.Compared with BC group,aP＜0.05.Compared with YY1 siRNA-NC group,bP ＜0.05.

組別Groups IL-2(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-10(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)BC 組BC Group 527.48±64.83 22.47±5.16 54.14±6.72 615.82±74.08 YY1 siRNA-NC 組YY1 siRNA-NC Group 571.08±52.19 25.1±6.18 57.01±8.29 644.29±80.82 YY1 siRNA-1675 組YY1 siRNA-1675 Group 1745.29±204.86ab 88.34±10.19ab 368.27±48.62ab 2854.07±340.16ab

3 討論

目前,臨床上治療膽囊癌主要以手術(shù)、化療、放療和分子靶向治療為主,但膽囊癌侵襲性強(qiáng),術(shù)后易復(fù)發(fā),導(dǎo)致患者生存率低[10]。近幾年,隨著臨床上對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的深入研究,免疫療法有望成為治療腫瘤的新興療法[11]。YY1 基因位于人14號(hào)染色體端粒區(qū),q32.2,其蛋白含有4 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),可與目的基因結(jié)合,具有激活或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄的作用,在多種腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組織、癌旁組織相比,膽囊癌組織中YY1 陽性表達(dá)率顯著升高,人膽囊癌細(xì)胞IH-GB1、SGC-996、GBC-SD 細(xì)胞較正常人膽囊上皮HGBEC細(xì)胞中YY1 水平升高,說明YY1 與膽囊癌相關(guān),其中以GBC-SD 細(xì)胞中YY1 水平最高,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以GBC-SD 細(xì)胞進(jìn)行。

PD-L1 是負(fù)向免疫調(diào)節(jié)信號(hào),可抑制腫瘤特異性CD8+T 細(xì)胞增殖和免疫活性,參與免疫逃逸,臨床上PD-L1 抗體的免疫治療已經(jīng)成為抗腫瘤治療和輔助治療的重要手段[13]。行PROMO 網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),YY1 序列 3’UTR 區(qū)存在 3 個(gè) PD-L1 結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)YY1 可調(diào)控 PD-L1 表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染 YY1 siRNA-1675 后,轉(zhuǎn)染 YY1 siRNA-1675 后,與BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組GBC-SD 細(xì)胞YY1 水平降低,說明YY1 siRNA-1675轉(zhuǎn)染成功,YY1 siRNA-1675 組較BC 組、YY1 siRNANC 組PD-L1 水平隨之降低,說明抑制YY1 表達(dá),可下調(diào)PD-L1 水平。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明PD-L1 是YY1 的作用靶點(diǎn),說明 YY1 可靶向調(diào)控PD-L1 表達(dá)。

PD-L1 是腫瘤免疫研究的熱點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn),PDL1 在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高組織學(xué)級(jí)別、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞PD-1 陽性相關(guān)[14]。在膠質(zhì)瘤組織中PD-L1 陽性表達(dá)率顯著升高,可促進(jìn) T 細(xì)胞凋亡[15]。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血單核細(xì)胞和T 細(xì)胞中PD-L1高表達(dá),通過抑制T 細(xì)胞增殖,參與NSCLC 細(xì)胞免疫逃逸進(jìn)程[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與 BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組人 T 淋巴細(xì)胞凋亡率降低,說明下調(diào)PD-L1 能夠降低人T 淋巴細(xì)胞凋亡率,抑制GBC-SD 細(xì)胞免疫逃逸。研究顯示,調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞可分泌 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 等相關(guān)因子,參與細(xì)胞免疫和體液免疫[17]。CD25 和CD69 是T 細(xì)胞活化的標(biāo)記物,其水平與T 細(xì)胞活性呈正相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn),與 BC 組、YY1 siRNA-NC 組相比,YY1 siRNA-1675 組細(xì)胞上清液中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ 水平升高,T 淋巴細(xì)胞CD69、CD25 水平升高,說明下調(diào)PD-L1 水平可促進(jìn)T 細(xì)胞活化,從而分泌細(xì)胞因子,參與免疫進(jìn)程。

綜上所述,在 GBC-SD 細(xì)胞中 YY1、PD-L1 均高表達(dá),YY1 可靶向調(diào)控PD-L1 參與膽囊癌免疫逃逸進(jìn)程。但是YY1、PD-L1 在膽囊癌組織中的表達(dá)水平及與臨床病理特征的關(guān)系有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。