LncRNA HULC通過miR-372/CXCR4軸來調控肝癌細胞的增殖、凋亡與上皮-間質轉化

劉遠光劉懷海

(1.河北省唐山市工人醫院肝膽外科,河北唐山 063000; 2.河北醫科大學第二醫院普外科,石家莊 050000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是高風險、高度有害的惡性腫瘤,對人類健康構成威脅[1]。此外,肝癌的發病機理尚未完全了解。據報道,環境和飲食因素影響肝癌的發生。目前,手術仍是肝癌治療的首選。但是,肝癌的復發率仍然很高,其5 年生存率一般低于50%[2]。因此,探索肝癌的發病機制以篩選有效的診斷標志物和治療靶點對于肝癌患者非常迫切。

長非編碼RNA(LncRNA)是一類RNA 轉錄物,長度大于200 個核苷酸[3]。LncRNA 可以調節蛋白質編碼基因、轉錄和轉錄后,并在生物學過程中發揮重要作用[4]。研究表明,已LncRNA 在生物學過程中的許多功能,包括心血管疾病、炎癥反應和癌癥[5]。這些作用由表觀遺傳調控、轉錄和轉錄后調控介導。在 HCC 中已鑒定出許多 LncRNA,例如H19、HOTAIR、MALAT1 和 MEG3[6]。肝癌中高度上調(highly upregulated in liver cancer,HULC)是一種長的非編碼RNA(lncRNA),最近已被確定為肝細胞癌,神經膠質瘤和胃癌進展中的關鍵調節劑[7]。研究表明,HULC 在肝癌發生過程中發揮積極作用,例如,HULC 調節肝癌細胞中的脂質代謝[8]。因此,LncRNA 可以作為肝癌診斷、預后和藥物基因組學的潛在標志物。

microRNA(miRNA)是小的非編碼RNA,其長度約為22 個核苷酸,實際上參與了細胞所有過程,例如增殖、分裂分化、凋亡、蛋白質分泌和病毒感染過程[9]。通常,miRNA 通過抑制翻譯或誘導目標信使RNA(mRNA) 降解來負調控基因表達。但是,miRNA 也可以通過調節啟動子活性或激活翻譯來積極調節基因表達[10]。近幾年的研究表明miRNA在肝病發展和進展中的特定作用[11],提示miRNA可能與肝癌的發生發展有關。因此,miRNA 可以作為肝癌診斷、預后和藥物基因組學的潛在標志物。

C-X-C 趨化因子受體 4 (C-X-C chemokine receptor 4,CXCR4)是趨化因子配體12(CXCL12)特異受體。大量研究表明,CXCR4 與HCC 的發展有關,包括細胞增殖、血管生成、侵襲和轉移[12-13]。例如,HCC 細胞中EphA1 表達的升高增強了內皮祖細胞(EPC)向腫瘤部位的募集,從而通過激活SDF-1/CXCR4 軸來促進血管生成[14]。腫瘤內皮細胞中高水平的CXCR4 可以誘導腫瘤血管生成,從而促進腫瘤轉移并與HCC 患者的不良預后相關[15]。因此,CXCR4 在肝癌的發生發展中起著重要作用。

綜上所述,本研究分析了 LncRNA、miRNA 和mRNA 在HCC 組織和肝癌細胞系中的表達,研究分析了 HULC、miR-372 和 CXCR4 的潛在關系以及HULC/miR-372/CXCR4 軸對肝癌細胞增殖、凋亡與上皮-間質轉化的影響。我們的研究結果可能有助于增進對肝癌細胞分子機制的了解,LncRNA HULC可能作為HCC 的潛在診斷生物標志物和治療靶標。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床組織

所有腫瘤組織(20 例)和配對的癌旁正常組織(20 例)均來自接受肝癌切除手術的患者。所有患者均未接受任何栓塞治療或在手術前進行化學療法,并在術后進行病理診斷。所有患者均簽署了知情同意書,所有實驗均獲得本醫院倫理委員會的批準與監督(IACUC2018011505)。每個組織標本都保存在-80℃直至使用。

1.1.2 實驗細胞

六種 HCC 細胞系 Huh7 (批號:SAc0188)、Hep3B(批號:I110643)、MHCC-97L(批號:YCL-0497)、MHCC-97H(批號:CL-H153)、SMMC-7721(批號:L4821)、HepG2(批號:YS-C3688)和正常肝細胞系(LO2,批號:0158),均購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640 培養基 (批號: CD-100043GM)、DMEM 培養基(批號:BH-S3208)和胎牛血清(批號:164210-500)(美國 Gibco 公司);CCK-8 試劑盒(批號:IC-CCK8-Hu)、青霉素(批號:B25911)和鏈霉素(批號:S66602)(美國 Sigma 公司);TRIzol 試劑(批號:CD102523GM)、cDNA 逆轉錄試劑盒(批號:4368814)和 SYBR Premix EX TaqTM試劑盒(批號:RR420A)(日本 TaKaRa 公司);陰性對照、miR-372 mimics、miR-372 inhibitor ( Genepharma 公 司 );PcDNA3.1-control、pcDNA3.1-HULC、si-control、si-HULC 和 LipofectamineTM3000(批號:L3000015)(美國Invitrogen 公司);pmirGLO 載體(批號 GN1439)、雙熒光素酶活性檢測試劑盒(批號:C-8304)(美國Promega 公司);Annexin V-FITC/PI 試劑盒(批號:120248)、RIPA 裂解液(批號:R21235)(英國 Abcam公司);DAB 顯色劑(批號:SNM477-ARB,北京百奧萊博科技有限公司);雙氧水(批號:R23672,揚州市天泰化工有限公司); E-cadherin 抗體(批號:3195T)、Vimentin 抗體(批號:5741T)、β-actin 抗體(批號:4970T)和山羊抗兔IgG 二抗(批號:2985S)(美國 Cell Signaling Technology 公司)。SDS-PAGE電泳儀(型號:DYY-7C,北京六一生物科技有限公司);凝膠掃描儀(型號:4466611,美國BIO-RAD 公司);酶標儀(型號:SMR16.1,上海科華實驗系統有限公司);流式細胞儀(型號:1026,美國BD 公司);StepOnePlus Real-Time PCR System(型號:401411,日本 TaKaRa 公司);倒置相差顯微鏡(型號:CKX53,日本 Olympus 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

LO2 細胞用含10%胎牛血清和100 IU/mL 青霉素、100 IU/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 培養基培養;Huh7、Hep3B、MHCC-97L、MHCC-97H,SMMC-7721和HepG2 細胞用含10%胎牛血清和100 IU/mL 青霉素、100 IU/mL 鏈霉素的DMEM 培養基培養,置于37℃、5% CO2的培養箱,2 d 更換一次培養基,以保證細胞所需的營養成分。取對數期、狀態良好的細胞進行后續實驗。

1.3.2 Quantitative real time RT-PCR(qRT-PCR)

用TRIzol 試劑提取組織樣本或者細胞總RNA。用Nanodrop 2000 儀器測量樣品總RNA 濃度,并將每個配對的樣品調節至相同濃度。然后按照cDNA逆轉錄試劑盒將總 RNA 反轉錄成 cDNA。使用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒進行 qRT-PCR。U6和 β-actin 分別用作 LncRNA、miRNA 和 mRNA 的內部參考。使用FTC-3000p 實時PCR 系統完成實驗后,采用 2-△△Ct法分析數據。其中使用的引物見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.3 細胞轉染

按照LipofectamineTM3000 轉染試劑說明書將質粒(陰性對照、miR-372 mimics、miR-372 inhibitor、pcDNA3.1-control、pcDNA3.1-HULC、si-control 和 si-HULC)分別轉入至 MHCC-97L 和 HepG2 細胞中。在37℃、5% CO2的培養箱中培養6 h 后,更換新鮮的培養基繼續培養。48 h 后結束培養,收集各組細胞進行后續實驗。

1.3.4 雙熒光素酶報告基因檢測

通過 TargetScan 數據庫分析 miR-372 分別與HULC 和CXCR4 的非編碼區區域的結合位點。將HULC 3′UTR wt/mut 或 CXCR4 3′UTR wt/mut 克隆到pmirGLO 載體中,然后將陰性對照、miR-372 mimics、miR-372inhibitor、pmirGLO-HULC-wt、pmirGLO-HULC-mut、pmirGLO-CXCR4-wt 或pmirGLO-CXCR4-mut 轉染至 MHCC-97L 或 HepG2細胞中。48 h 后,用雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定MHCC-97L 細胞和HepG2 細胞的熒光素酶活性。

1.3.5 CCK-8

將轉染后的細胞接種到96 孔板上,培養24、48、72、96 h。然后,將 10 μL CCK-8 溶液添加到每個孔中,并在37°C 下孵育2 h。最后,使用自動酶標儀檢測在450 nm 波長的吸光度。

1.3.6 細胞集落形成實驗

將MHCC-97L、HepG2 細胞分別接種到6 孔板中,并用指定的質粒轉染。48 h 后,收集各組細胞并鋪在60 mm 的培養皿中。3 d 更換一次培養基。14 d 后,用結晶紫染色,并計數含有≥50 個細胞的集落,并進行拍照。

1.3.7 細胞流式術

收集轉染的各組細胞,離心并重懸于結合緩沖液中。將細胞依次用異硫氰酸熒光素(Annexin VFITC)溶液(10 μL)和碘化丙啶(PI)溶液(10 μL)染色。將染色的細胞在室溫下黑暗中孵育30 min,然后使用FACSCaliburTM流式細胞儀進行分析。

1.3.8 免疫組織化學染色

組織經固定、包埋、石蠟切片、脫水、緩沖液清洗,3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶,滴加非免疫動物血清20 min,滴加一抗、PBS 沖洗、滴加二抗、沖洗后加 ABC 復合物、DAB 顯色,在400 倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.9 Western blot

各組細胞用RIPA 裂解提取總蛋白,并通過BCA 方法進行定量,樣品經變性后進行上樣。按照實驗步驟進行電泳-轉膜-封閉(5%脫脂奶粉)-一抗孵育(4℃過夜)-二抗孵育(室溫1 h)-顯影曝光。Image-Pro Plus 圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.4 統計學方法

統計學分析用SPSS 19.0 軟件進行,至少取3次獨立實驗結果,以平均數±標準差(±s)表示,多組間數據比較采用單向方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HULC 在肝癌組織和肝癌細胞中高表達

qRT-PCR 結果表明HULC 在肝癌組織和肝癌細胞中高表達:與癌旁非腫瘤組織組相比,HULC 在肝癌組織中表達上調(P＜0.01,圖1A);與LO2 細胞相比,在六個HCC 細胞系中均觀察到HULC 高表達,其中,MHCC-97L 細胞中 HULC 表達最低(P＜0.05),而 HepG2 細胞中 HULC 表達最高(P＜0.001,圖1B),因此,因此這兩種細胞系分別用于功能增強和功能缺失實驗。總之,研究人員得到結論:HULC 在肝癌組織和肝癌細胞中高表達。

圖1 HULC 在肝癌組織和肝癌細胞中的表達Figure 1 HULC expression in liver cancer tissues and liver cancer cells

2.2 HULC 對HCC 細胞增殖和凋亡的影響

pcDNA3.1-HULC 轉染 MHCC-97L 細胞,si-HULC 轉染 HepG2 細胞。qRT-PCR 分析顯示,pcDNA3.1-HULC 和 si-HULC 在 MHCC-97L 和HepG2 細胞中顯著調節了 HULC 的表達(均P＜0.01,圖2A、2B)。從功能上看,CCK-8 分析表明,過表達HULC 明顯增強MHCC-97L 細胞的活力(P＜0.01;圖2C),而低表達HULC 明顯減弱HepG2 細胞的活力(P＜0.01,圖2D)。細胞集落形成實驗表明,過表達HULC 明顯增強MHCC-97L 細胞的增殖能力(P＜0.01,圖2E),而低表達HULC 明顯減弱HepG2細胞的增值能力(P＜0.01,圖2F)。細胞流式術結果表明,過表達HULC 明顯抑制MHCC-97L 細胞的凋亡能力(P＜0.01,圖2G),而低表達 HULC 明顯增強HepG2 細胞的凋亡能力(P＜0.01,圖2H)。

2.3 HULC 對 HCC 細胞 EMT 的影響

免疫組織化學染色揭示了HULC 和EMT 標記物(E-cadherin 和Vimentin)之間的關聯,結果表明,與低表達HULC 組相比,過表達HULC 組的HCC 組織具有較低的E-cadherin 和較高的Vimentin 表達(P＜0.01,圖3A)。Western blot 結果表明,過表達HULC 可以明顯抑制MHCC-97H 細胞中E-cadherin的表達并提高Vimentin 的表達(均P＜0.01);低表達HULC 可提高 HepG2 細胞中 E-cadherin 的表達并抑制 Vimentin 的表達(均P＜0.01,圖3B)。綜上所述,HULC 促進HCC 細胞的增殖、抑制HCC 細胞凋亡以及促進HCC 細胞EMT 的進展。

2.4 miR-372 是 HULC 的靶標

TargetScan 數據庫揭示了 miR-372 與 HULC 的潛在結合位點(圖4A)。qRT-PCR 的數據表明,miR-372 在肝癌組織和肝癌細胞中的表達明顯下降(均P＜0.01,圖4B、4C)。Pearson 相關分析顯示,miR-372 與 HCC 組織中的 HULC 表達相關分析表明,在肝癌組織中觀察到miR-372 與HULC 表達之間呈負相關(r=-0.56,P＜0.001,圖4D)。接下來,分別將 MHCC-97L 和 Hep2G 細胞轉染了miR-372 抑制劑和 miR-372 模擬物,qRT-PCR 證實miR-372 的低表達和過表達(均P＜0.05,圖4E)。雙熒光素酶報告基因測定表明,miR-372 明顯抑制了攜帶HULC 3′UTR wt 的熒光素酶活性,但當報告質粒攜帶HULC 3′UTR mut 時未觀察到明顯的抑制作用(均P＜0.01,圖4F)。此外,HULC 可以負調控HCC 細胞中miR-372 的表達(均P＜0.05,圖4G)。另一方面,通過調節HCC 細胞中的miR-372 水平,HULC 表達明顯升高或降低(均P＜0.01,圖4H)。綜上所述,HULC 可直接與 HCC 細胞中的 miR-372 結合,且兩者具有相互抑制的作用。

圖2 HULC 促進HCC 細胞的增殖、抑制HCC 細胞凋亡Figure 2 HULC promotes HCC cell proliferation and inhibits HCC cell apoptosis

圖3 HULC 促進 HCC 細胞 EMT 進展Figure 3 HULC promotes the EMT progression of HCC cells

2.5 miR-372 對HCC 細胞的增殖和凋亡的影響

CCK-8 分析表明,低表達miR-372 明顯增強了MHCC-97 的活力(P＜0.01),而過表達 miR-372 明顯降低HepG2 細胞的活力(P＜0.01,圖5A)。細胞集落形成實驗表明,低表達miR-372 明顯增強了MHCC-97 的增殖能力(P＜0.01),而過表達miR-372明顯降低HepG2 細胞的增殖能力(P＜0.01,圖5B)。細胞流式結果表明,敲低 miR-372 明顯抑制了MHCC-97 的凋亡能力(P＜0.05),而過表達miR-372明顯增強HepG2 細胞的凋亡能力(P＜0.01,圖5C)。

2.6 miR-372 對 HCC 細胞 EMT 的影響

免疫組織化學染色以探討miR-372 和EMT 標記物(E-cadherin 和Vimentin)之間的關聯,結果表明,與高 miR-372 組相比,低 miR-372 組的 E-cadherin 表達明顯降低,且Vimentin 表達明顯升高(均P＜0.01,圖6A)。此外,Western blot 分析顯示,低表達 miR-372 可降低 MHCC-97L 細胞中 E-cadherin 的表達并增加 Vimentin 的表達含量(P＜0.01),而過表達 miR-372 抑制了 HepG2 細胞的EMT 過程(均P＜0.01,圖6B)。因此,我們得出的結論是miR-372 可以抑制HCC 細胞的增殖、促進凋亡以及抑制HCC 細胞EMT 的進展。

2.7 miR-372 直接靶向HCC 細胞中的CXCR4

TargetScan 預測了 miR-372 與 CXCR4 的結合位點(圖7A)。qRT-PCR 的數據表明,CXCR4 在肝癌組織和肝癌細胞中的表達明顯上調降(均P＜0.05,圖7B、7C)。Pearson 相關分析顯示,miR-372 與HCC 組織中CXCR4 表達相關分析表明,在肝癌組織中觀察到miR-372 與CXCR4 表達之間呈負相關(r=-0.415,P＜0.01,圖7D)。使用雙熒光素酶報告基因檢測CXCR4 的表達是否受miR-372 調節,結果表明,當報告質粒攜帶CXCR4 3′UTR wt 時,miR-372 抑制了HCC 細胞中的熒光素酶活性,但當報告質粒攜帶CXCR4 3′UTR mut 時未觀察到明顯的抑制作用(均P＜0.01;圖7E)。qRT-PCR 分析結果表明,miR-372 可以直接靶向 CXCR4,并負調節CXCR4 在 HCC 細胞中的表達(均P＜0.01,圖7F)。接下來,我們探討了HULC 是否可以調節CXCR4 的表達,數據表明,CXCR4 表達可以在肝癌細胞中受到 HULC 的正調控(均P＜0.01,圖7G)。因此,我們得出的結論是,CXCR4 是miR-372 的直接靶標,并且在HCC 細胞中受到HULC 的正調控。

圖4 miR-372 在肝癌組織和肝癌細胞中的表達以及與HULC 的關系Figure 4 miR-372 expression in liver cancer tissues and liver cancer cells and its relationship with HULC

2.8 HULC/miR-372/CXCR4 軸可影響肝癌細胞的增殖、凋亡與EMT

qRT-PCR 結果表明,在 MHCC-97L 細胞中,過表達HULC 使CXCR4 表達上調,而過表達miR-372下調了 CXCR4 的表達(P＜0.01);在 HepG2 細胞中,低表達HULC 使CXCR4 的表達下調,而低表達miR-372 上調了 CXCR4 的表達(P＜0.01,圖8A)。CCK-8 分析表明,過表達 HULC 使MHCC-97L 細胞活力增強,而過表達miR-372 降低了細胞活力(P＜0.01);低表達HULC 降低了HepG2 細胞活力,而低表達 miR-372 增加細胞活力(P＜0.01,圖8B)。細胞集落形成實驗表明,過表達HULC 使MHCC-97L細胞的增殖能力增強,然而過表達miR-372 降低了細胞的增殖能力(P＜0.001);低表達HULC 降低了HepG2 細胞的增殖能力,而低表達miR-372 增強細胞的增殖能力(P＜0.001,圖8C)。細胞流式術結果表明,過表達HULC 使MHCC-97L 細胞凋亡能力減弱,然而過表達miR-372 提高了細胞的凋亡能力(P＜0.01);低表達HULC 提高了HepG2 細胞的凋亡能力,而低表達miR-372 減弱了細胞的凋亡能力(P＜0.001,圖8D)。Western blot 結果表明,與 pcDNA3.1-HULC 組相比,過表達 miR-372 可增加 MHCC-97L 細胞中E-cadherin 的表達并減少Vimentin 的表達(均P＜0.01);與 si-HULC 組比,低表達 miR-372 可減少HepG2 細胞中E-cadherin 的表達并增加Vimentin 的表達(均P＜0.01,圖8E)。因此,我們證明了 HULC可通過HULC/ miR-372/CXCR4 軸發揮其對HCC 增殖、凋亡和EMT 的影響作用。

圖5 miR-372 抑制HCC 細胞的增殖、促進HCC 細胞凋亡Figure 5 miR-372 inhibits HCC cell proliferation and promotes HCC cell apoptosis

圖6 miR-372 抑制 HCC 細胞 EMT 進展Figure 6 miR-372 inhibits the EMT progression of HCC cells

圖7 CXCR4 在肝癌組織和肝癌細胞中的表達以及與miR-372 的關系Figure 7 CXCR4 expression in liver cancer tissues and liver cancer cells and its relationship with miR-372

圖8 HULC/miR-372/CXCR4 軸調節肝癌細胞的細胞增殖、凋亡與EMTFigure 8 HULC/miR-372/CXCR4 axis regulates cell proliferation,apoptosis and EMT of liver cancer cells

3 討論

在全球范圍內,肝細胞癌(HCC)占所有肝癌病例的75%～85%[16]。據估計,2015 年中國有46.61萬新診斷的肝癌患者,占全球所有肝癌病例的50%以上[17]。顯然,肝癌對中國人民而言是沉重的公共衛生威脅[18]。因此,進一步研究肝癌進展的機制,為肝癌治療提供更多的靶標。

人類基因組計劃表明,大約90%的基因組被轉錄為非編碼RNA[19]。據報道,非編碼RNA,包括長非編碼RNA(LncRNA,長度超過200 個核苷酸)和microRNA(miRNA,長度為 18 ～25 個核苷酸),是癌癥和其他疾病的關鍵調節因子[20-21]。另外,LncRNA 和miRNA 能夠調節幾乎所有與癌癥發生和發展有關的過程。LncRNA HULC 與癌癥進展有關[7]。研究表明,HULC 在肝癌發生過程中發揮積極作用,例如,HULC 調節肝癌細胞中的脂質代謝[8]。而且 HULC 增強上皮-間質轉化(EMT),促進肝癌細胞的轉移[22]。本實驗中,我們發現HULC 在肝癌組織和肝癌細胞中高表達,且HULC 可促進肝癌細胞增殖和EMT、抑制細胞凋亡。因此,HULC 有可能作為一類新型的潛在生物標志物或癌癥的治療靶標。

miRNA 是一類內源性、高度保守的、小的非蛋白質編碼RNA,長度約為22 個核苷酸[23]。miRNA在許多生物中表達,并通過復雜的過程在調節靶基因表達中發揮作用[24]。miR-372 屬于miR-371-372基因簇,位于染色體19q13.42。研究表明,miR-372可調節許多類型人類癌癥中的細胞周期、凋亡、侵襲和增殖[25]。Lai 等[26]研究表明,miR-372 可能在非小細胞肺癌患者中轉錄后下調大腫瘤抑制基因2,從而導致腫瘤的發生和增殖。但是,miR-372 在肝癌中的作用尚不清楚,有研究表明 miR-372 在HCC 中低水平表達,并且通過負控制其靶基因ATAD2 發揮抗癌基因作用[27]。我們的實驗結果表明miR-372 在肝癌組織和肝癌細胞中低表達,與上述文獻一致。我們還發現,過表達miR-372 可能會顯著抑制肝癌細胞的增殖和EMT,促進其凋亡。因此,miR-372 可能作為具有足夠敏感性和特異性的一系列生物標志物的候選物,用于臨床診斷HCC。

CXCR4 在20 多種腫瘤類型中過表達,并且在腫瘤生長、腫瘤侵襲性、癌細胞微環境相互作用和轉移中起關鍵作用[28]。CXCR4 的存在與多種不同腫瘤實體的不良結局有關,包括血液系統惡性腫瘤、乳腺癌、腎細胞癌、婦科惡性腫瘤、胰腺腺癌和肝細胞癌[29]。本實驗研究發現,CXCR4 在肝癌組織和肝癌細胞中高表達,低表達CXCR4 可能會抑制肝癌細胞的增殖和EMT,促進其凋亡。

因此,了解 LncRNA、miRNA 和 mRNA 之間的相互作用關系將有助于深入了解疾病。

本實驗中發現 miR-372 可能靶向 HULC 和CXCR4,并且通過靶向關系進行負調控,進一步影響HCC 細胞的增殖、凋亡和 EMT。因此,HULC/miR-372/CXCR4 軸可能促進 HCC 細胞的增殖和EMT 進程、抑制細胞凋亡,這可能是將來HCC 有價值且有希望的治療靶點。

綜上所述,這項研究說明了肝癌中HULC、miR-372 與CXCR4 之間的分子相互作用。低表達HULC通過miR-372/CXCR4 軸抑制肝癌的發生和發展。這些結果表明,HULC/miR-372/CXCR4 軸可以用作緩解肝癌進展的有希望的治療靶標。