miR-199a在LPS誘導的大鼠原代心肌細胞中通過激活NF-κB信號通路加重心肌細胞損傷

王 可董平栓*和素娜陳士芳趙希坤張恒亮王騰飛

(1.河南科技大學第一附屬醫院,河南洛陽 471003; 2.河南科技大學醫學院,河南 洛陽 471003)

心肌炎是一種炎癥性心肌病,其特征主要表現在心肌細胞的水腫,變性和壞死[1]。心肌病變時出現廣泛的炎癥浸潤和氧化應激反應,最終導致惡性心律失常、心源性休克甚至心臟驟停。從病原微生物釋放的許多內源性和外源性因子,如自身抗原,病毒和內毒素,可以激活免疫反應,從而促進炎性細胞因子短時間大量釋放,并伴有大量的活性氧(ROS)[2]的產生,它直接損害心臟功能,最終導致患者的死亡。另外除了病原生物感染外,敗血癥或敗血癥性休克也是一種潛在的致命疾病,與強烈的全身性炎癥反應有關,最終可能導致心肌嚴重的炎癥異常。脂多糖(LPS),也稱為內毒素[3],由細菌釋放,促進促炎細胞因子,一氧化氮和類二十烷酸的分泌,導致膿毒性休克期間的中毒性心肌損傷。心肌炎心細胞凋亡發生發展[4]。

微小RNA(miRNA)是由18 ～25 個核苷酸組成的大型非編碼小RNA 家族。miRNA 在轉錄后調節其靶基因的降解和翻譯[5]。miRNA 參與炎癥反應和自身免疫性疾病的發展,如類風濕性關節炎和多發性硬化[6]。越來越多的證據表明miRNA 參與心肌細胞凋亡的調控過程。例如,miR-101 和miR-29b均靶向Mcl-1 以防止細胞凋亡,而miR-499a 通過抑制組蛋白脫乙酰酶8 的表達而損害肌細胞存活。此外,miR-34a 通過下調SIRT1 的表達和誘導 p53 途徑誘導細胞凋亡,而miR-16 通過靶標參與細胞活力和凋亡。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡,是體內組織更新和器官發育的重要生物學過程,也可誘導病理生理變化[7]。例如,心肌細胞凋亡可能導致不可逆的心肌損傷,因此參與多種病理過程,從而導致各種心血管疾病,包括心肌炎、心力衰竭(HF)等。因此,人們普遍認為抑制細胞凋亡可以改善心臟組織中的病理變化并有益于改善各種心臟疾病中的心臟功能[8]。

最近的研究顯示[9],與對照心臟相比,大鼠心臟衰竭模型中miRNA 的表達具有差異性,發現上調的 miRNA 有 79 種,28 種 miRNA 下調。然而在那些上調的miRNA 中,發現與對照心臟相比,衰竭心臟中miR-199a 的表達高 3.4 倍。這些發現都表明miRNA 在心臟穩態中的潛在作用。最近的研究表明miR-199a 可以通過抑制自噬和促進細胞凋亡來破壞血管內皮細胞,從而加重原發性高血壓。另外近來的研究發現抑制miR-199a 對于心肌纖維化具有重要的作用。心肌炎是臨床的發病臨床較高的疾病,因此我們把焦點集中在miR-199a 對于心肌炎的作用上。這對于研究miR-199a 對于心肌炎損傷的作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60 只成年的SPF 級Wistar 大鼠購買于首都醫科大學實驗動物科學部[SCXK(京) 2018-0019],月齡為 2～3 個月,性別不限,體重 240～260 g。無菌手術在河南科技大學第一附屬醫院實驗設施進行[SYXK(豫)2017-0011]。實驗獲得我院倫理委員會審批([201810]號),并按實驗動物使用的3R 原則予以人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

miR-199a minic(模擬物)、miR-199a inhibitor(抑制劑)購自于銳博;凋亡檢測試劑盒(貨號:FA101)試劑盒購自于全式金生物;p65 抗體(貨號:8242T)、P65 抗 體 (貨 號:3033T)、iκBa (貨 號:4814T)、p-iκBa(貨號:2859T)抗體,以上抗體均購自于 CST 公司。酶標儀購自于 INFINITE;Western blot 實驗轉膜儀、電泳儀等購自于伯樂;Evodiamine購自于Selleck。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠心肌細胞的提取

無菌條件下使用無菌剪取大鼠心室肌組織,將提取的組織放于D-Hank 液中,并清洗去除血細胞;隨后將組織剪成小塊,轉移至50 mL 離心管中,靜止2 min 棄上清,加入10 mL 0.1%的胰酶,用無菌吸管將組織吹勻并放入37℃水浴鍋中。水浴加熱消化15 min,每 3 min 混勻 1 次。棄上清。重復 2 次;隨后按上述重新加入0.1%胰酶10 mL,消化15 min,后加入含10% FBS 的培養基終止消化并收集上清液。重復上述消化、收集細胞、終止消化等步驟5次,至組織變成白色。將收集的上清液按800 r/min離心,并用含10% FBS 的DMEM 培養基重懸。隨后培養并進行鑒定,發現純度＞98%。

1.3.2 實驗分組

將大鼠原代心肌細胞分為對照組(NC)、LPS組、LPS+miR-199a mimic 組、LPS+miR-199a inhibitor組;LPS 誘導劑量為 10 μg/mL。

1.3.3 CCK8 法檢測各組心肌細胞的活力水平

實驗分組同前,每孔鋪8000 個細胞,每組各8個副孔。細胞貼壁后進行模擬物及抑制劑干預,干預8 h 后進行LPS 處理,24 h 后進行 CCK8 實驗檢測大鼠原代心肌活力水平。

1.3.4 Western blot 法檢測各組蛋白表達

將大鼠原代心肌細胞分為對照組(NC)、LPS組、LPS+miR-199a mimic 組、LPS+miR-199a inhibitor組。各組每皿鋪8×105個細胞。待細胞貼壁后進行miR-199a 模擬物或抑制劑處理。干預處理8 h 后進行LPS 干預,24 h 后裂解液進行裂解,提取蛋白。隨后進行蛋白凝膠電泳及顯像分析。

1.3.5 RT-qPCR 法檢測各組大鼠原代心肌細胞中miR-199a 情況

運用TRIzol 法提取大鼠原代心肌細胞中的總RNA,隨后進行逆轉錄。逆轉錄體系為20 μL:1 μL總 RNA,4 μL 5×Reaction Mix,2 μL 10×Super Script Enzyme Mix,20 μL 雙蒸水,輕輕混勻后離心。隨后在37℃下60 min,95℃下5 min 下進行逆轉錄。逆轉錄完成后,隨后進行qPCR,總體系50 μL:1 μL cDNA,2 μL Mix,上下游引物各 2 μL,ddH2O 補足至50 μL;反應條件:95℃,預變性 5 min;95℃,變性30 s,67℃,延伸15 s,共40 個循環。基因的相對表達量用2-△△CT法進行計算。

引物序列如下:

β-actin 上 游 序 列: 5’-CATTGCTGACAGGAT GCAGAAGG-3’; 下 游 序 列: 5’-TGCTGGAAGGT GGACAGTGAGG-3’;miR-199a 上游序列:5’-CCAG TGTTCAGACTACC-3’,下 游 序 列: 5 ’-GAACA TGTCTGCGTATCTC-3’;

1.3.6 流式細胞儀測定各組大鼠原代心肌細胞凋亡差異

實驗分組同前。1、細胞鋪板,6 孔板每孔鋪2×105個細胞。貼壁后進行相應處理。2、LPS 處理24 h后進行凋亡檢測,收集培養液上清,終止消化后,3000 r/min 離心。隨后棄上清,用 100 μL AV Buffer 重懸細胞,重懸后按 1:10 的比例加入Annexin V-FITC 進行常溫孵育20 min,上機前加入碘化丙啶進行染色。

1.3.7 ELISA 法測各組中 TNF-α 和 IL-1β 含量

根據ELISA 試劑盒(Invitrogen,CA,USA)操作指導,取大鼠原代心肌細胞上清液檢測 TNF-α 和IL-1β 的水平。用酶標儀(BioTekPowerWave XS,Winooski,VT,USA)在450 nm 的波長下測定標準品和樣品。每個實驗重復3 次。

1.3.8 抑制 NF-κB 通路研究 miR-199a 對于 LPS誘導后心肌細胞的影響。

實驗分為對照組(con)、LPS 組、LPS+miR-199a mimic 組、LPS+miR-199a mimic+Evodiamine 組,利用NFκB 信號通路抑制劑 Evodiamine,研究其對于miR-199a 處理后細胞的作用。

1.4 統計學方法

統計學分析結果使用SPSS 18.0 軟件分析。計量資料以平均數±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-199a 抑制了心肌炎時心肌細胞的活力

如圖1 所示,為了研究miR-199a 對于心肌炎時心肌細胞的活力作用。與對照組相比,LPS 抑制了大鼠原代心肌細胞的活力(P＜0.01),然而LPS誘導后經模擬物處理后,大鼠原代心肌活力受抑制更加嚴重(P＜0.05)。表明 miR-199a 在心肌炎中可能加重了心肌細胞的損傷,同時,miR-199a 抑制劑組表明,與模擬物相比,抑制miR-199a 后發現LPS 誘導的大鼠原代心肌細胞活力受抑制降低(P＜0.01)。

2.2 miR-199a 促進了心肌炎時心肌細胞炎癥因子的釋放

ELISA 結果如圖2 所示,與 NC 組相比,LPS 誘導了 TNF-α 及 IL-1β 的釋放(P＜0.05)。與 LPS 組相比,miR-199a 模擬物組加重了 TNF-α(P＜0.01)及 IL-1β(P＜0.05)的釋放。然而,經過 miR-199a 抑制劑處理后,TNF-α(P＜0.01)及 IL-1β(P＜0.05)的釋放減少。

2.3 miR-199a 加重了心肌炎時心肌細胞的凋亡

為了研究心肌炎時miR-199a 在心肌細胞中的凋亡效應,如圖3 所示,流式凋亡結果表明,與對照組相比,LPS 誘導了大鼠原代心肌細胞的凋亡(P＜0.01),應用 50 nmol/L 的 miR-199a 模擬物后,與LPS 組相比,大鼠原代心肌細胞凋亡比例上調(P＜0.05)。與模擬物相比,miR-199a 抑制劑組,大鼠原代心肌細胞凋亡明顯降低(P＜0.01)。表明miR-199a 可能通過影響凋亡來加重心肌炎的損傷。

圖1 miR-199a 抑制了心肌炎時心肌細胞的活力Figure 1 miR-199a inhibits cardiomyocyte proliferation during myocarditis

圖2 miR-199a 促進了心肌炎時心肌細胞炎癥因子的釋放Figure 2 miR-199a promotes the release of inflammatory cytokines in myocarditis

2.4 miR-199a 上調了心肌炎時心肌細胞凋亡相關蛋白的表達

如圖4 所示與對照組相比,LPS 誘導組凋亡相關蛋白變化。LPS 誘導后,caspsse3、bax 表達上調,bcl2 表達下調。表明LPS 誘導了心肌細胞的凋亡。然而,模擬物組加重了LPS 誘導的凋亡蛋白的變化。與此同時,抑制miR-199a 后發現,與模擬物組相比,凋亡蛋白 caspsse3、bax 表達下調,bcl2 表達上調。這表明miR-199a 加重了心肌細胞的的損傷。

2.5 miRNA-199a 加重了 LPS 誘導的 NF-κB 通路的激活

如圖5 所示,與對照組相比,LPS 誘導了大鼠原代心肌細胞NF-κB 通路的激活,具體表現為p-iκBa與p-p65 表達的上調。但與LPS 組相比,在模擬物處理后,p-p65 和 p-iκBa 上調更加明顯。與此同時,阻斷microRNA 表達后,與模擬物組相比,p-p65和p-iκBa 表達下調。這些發現表明用模擬物處理可以加重體內LPS 誘導的心肌炎中NF-κB 信號傳導途徑的激活。

2.6 抑制 NF-κB 通路緩解 miR-199a 對于 LPS 誘導的細胞的損傷

如圖6 所 示,利 用 NF-κB 通 路 抑 制 劑Evodiamine,發現與模擬物組相比,應用Evodiamine干預后,大鼠原代心肌細胞活力下降(P＜0.01),這進一步說明,miR-199a 可加重心肌炎時心肌細胞的損傷,這種損傷主要通過 NF-κB 信號通路來實現的。

圖3 miR-199a 加重了心肌炎時心肌細胞的凋亡Figure 3 miR-199a aggravates cardiomyocyte apoptosis in myocarditis

圖4 miR-199a 上調了心肌炎時心肌細胞凋亡相關蛋白的表達Figure 4 miR-199a up-regulates the expression of cardiomyocyte apoptosis-related proteins in myocarditis

圖5 miRNA-199a 加重了 LPS 誘導的 NFκB 通路的激活Figure 5 miR-199a aggravates the activation of LPS-induced NFκB pathway

圖6 抑制NF-κB 通路緩解miR-199a 對于LPS誘導的細胞的損傷Figure 6 Inhibition of NFκB pathway alleviates miR-199a damage to LPS-induced cells

3 討論

目前關于心肌炎的發生發展機制尚未明確,但抑制心肌細胞凋亡來延緩心肌炎的進展已經成為共識[10]。NF-κB 是一核轉錄因子可被 LPS 誘導的TLR2 信號通路所激活。其由 Rel、P65、RelB、P50、P52 五個亞基構成[11]。在未激活的前提下,NF-κB與IκK(IκB 激酶復合體)相結合,因此處于失活的狀態。因此 IκK 是激活 NF-κB 信號傳導通路的主要環節。其激活分為經典途徑與非經典途徑兩種方式。經典途徑為,當刺激激活 IκK 后,IκB 蛋白被磷酸化,NF-κB 與 IκK 分離,失去抑制作用的 NF-κB入核發揮生物學作用。在非經典途徑中,P100 被降解為強活性的P52,其與RelB 相互作用入核發揮轉錄活性[12]。綜上NF-κB 信號通路促進參與調節細胞轉化,細胞凋亡和對多種刺激的反應的各種生物學過程,例如應激,細胞因子和自由基,其在調節免疫應答中起關鍵作用。然而,過度激活的NF-κB 途徑可能誘發持續和長期的系統性炎癥,這是急性心肌病變的主要原因之一[13]。有研究表明通過激活Nrf2 / HO-1 途徑抑制NF-κB 信號通路后可減輕糖尿病引起心肌的氧化應激和炎性滲出[14]。因此,阻斷NF-κB 通路的不當激活,特別是阻止轉錄因子p65 的核轉位,有助于阻斷自身免疫系統的過度活化[15]。NF-κB 通路的激活對于心肌細胞中促炎細胞因子的產生是必需的。MicroRNA-199a(miR-199a)是一種新型基因調節因子,在炎癥和損傷中扮演著重要作用。我們發現MicroRNA-199a 被抑制后可靶向SFRP5 來抑制心肌纖維化的進展[16]。其前體基因位于染色體1 和19 上。經剪切后,它轉化為成熟的miR-199a-5p 和 miR-199a-3p。目前,miR-199a-5p 已得到更廣泛的研究,揭示它與腫瘤細胞的活力,侵襲,遷移和自噬密切相關

在本研究中,我們通過CCK8 實驗發現miR-199a 加重了心肌炎時大鼠原代心肌細胞的損傷,同時我們發現這種損傷可能是通過凋亡相關通路來實現的,這一結果都得到了流式凋亡及Western blot的支持,隨后我們注意到LPS 誘導的心肌細胞NF-κB 信號通路得激活。然而,在 miR-199a mimic 組處理后,發現miR-199a 促進了核轉錄因子的核轉位。與 LPS 組相比,miR-199a 引起 IκB 與 p-iκBa 的失衡,進而導致 P65 的磷酸化進而導致 NF-κB 的激活。從而加重了心肌炎時的炎癥反應,加速了心肌細胞的凋亡。應用Evodiamine 干預后,大鼠原代心肌細胞活力下降,因此miR-199a 可能在心肌炎中進一步激活NF-κB 信號通路來加重心肌細胞的損傷。