基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討土茯苓治療發(fā)熱的作用機制

徐 炎韓 晶任曉婷王 雷王釔杰劉 良姚 博王中天孫麗平

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117; 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,長春 130021)

發(fā)熱是最常見的疾病指征之一,也在世界范圍內(nèi)醫(yī)療咨詢的首要原因[1]。兒童因為其“純陽之體”、“陽常有余,陰常不足”的生理病理特點,較之成人更容易罹患發(fā)熱性疾病[2]。據(jù)統(tǒng)計,以發(fā)熱為主訴就診的患兒約占兒科門診量的24.7%[3],主要表現(xiàn)為腋溫超過37.3℃、肛溫超過37.7℃、口溫超過37.8℃,部分嚴(yán)重疾病治療不及時可引起熱性驚厥、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、殘疾甚至死亡[4]。所以,在發(fā)熱初期或者低熱期有效控制體溫,對保護(hù)兒童神經(jīng)系統(tǒng)及治療原發(fā)疾病都有巨大好處。

國醫(yī)大師王烈教授經(jīng)60 余年臨床實踐,發(fā)現(xiàn)土茯苓不僅可以治療痛風(fēng)[5]、皮膚病[6]、心血管病[7]等疾病[8],其在治療各種原因引起的發(fā)熱也有良好效果,每遇發(fā)熱患兒,方中增加土茯苓清熱,藥到病除,效如桴鼓。

因發(fā)熱有50%為感染性因素引起[9],本研究著重探討感染性原因引起的發(fā)熱,探索五個感染性疾病:細(xì)菌性肺炎、急性扁桃體炎、急性下尿路感染、外陰陰道炎、細(xì)菌性腹瀉,可覆蓋大多數(shù)兒童發(fā)熱的病因。其中細(xì)菌性肺炎是全球嚴(yán)重的健康問題[10],是造成兒童死亡的首要因素[11];急性扁桃體炎是兒童及青少年的常見病和多發(fā)病,極易引起風(fēng)濕熱、腎炎、心肌炎等并發(fā)癥,扁桃體過度腫大可造成呼吸困難,引起呼吸暫停而危及生命[12];急性下尿路感染是最常見的泌尿系統(tǒng)疾病,可引起菌血癥、敗血癥、腎周膿腫等并發(fā)癥,嚴(yán)重者可進(jìn)展為腎衰竭[13];外陰陰道炎是小兒及青少年女性最主要的生殖道感染性疾病之一,不及時治療可嚴(yán)重威脅生殖健康[14];細(xì)菌性腹瀉是兒童消化系統(tǒng)最為常見的疾病,是導(dǎo)致嬰幼兒營養(yǎng)不良的主要原因,持續(xù)性的腹瀉可導(dǎo)致生長發(fā)育障礙[15]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探討土茯苓治療此五種疾病的具體機制。以期為土茯苓的進(jìn)一步的臨床、實驗研究及新的藥研發(fā)提供思路和依據(jù),文章最后探討了土茯苓治療發(fā)熱理論基礎(chǔ)及熱點問題。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究中土茯苓的成份與靶點從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php)獲取,疾病相關(guān)基因從 genecard 數(shù)據(jù)庫(https:/ /www.genecards.org) 獲取,靶點 Symbol 從 uniprot(https:/ /www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫獲取,分子對接蛋白構(gòu)象從PDB(http:/ /www.rcsb.org)網(wǎng)站獲取,蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI 網(wǎng)絡(luò))string(https:/ /string-db.org/)網(wǎng)站制作,使用Cytoscape(版本號:3.6.1)軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,使用R(版本號:3.6.1)軟件進(jìn)行富集分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 土茯苓成份及靶點信息

以“土茯苓” 為關(guān)鍵詞搜索 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php),并設(shè)定篩選條件為口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-like,DL)≥0.18,以確定可被人體吸收的活性成份[5]。并在Related Targets 欄目下根據(jù)上述活性成份獲取相應(yīng)靶點,并使用使用uniprot 進(jìn)行矯正。

1.2.2 疾病相關(guān)基因

以“Bacterial pneumonia、Bacterial diarrhea、Acute tonsillitis、Acute bacterial lower urinary tract infection、Vulvovaginitis” 為 關(guān) 鍵 詞 搜 索 genecard 數(shù) 據(jù) 庫(https:/ /www.genecards.org)獲取疾病相關(guān)基因。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建和分析

上述藥物靶點和疾病基因取交集后使用Cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)圖,并使用 NetworkAnalyzer插件分析Degree 值和Betweenness Centrality。

1.2.4 基因本體(GO)富集和基因組百科全書(KEGG)通路富集

使用 R 軟件中CludterProfiler 包進(jìn)行GO 富集分析和 KEGG 富集,設(shè)置 pvaluecutoff = 0.05,qvaluecutoff=0.05[16]。

1.2.5 分子對接

分子對接方法基于之前的研究[17],IL-6(PDB ID:4CNI)、EGFR(PDB ID:5UG9)、CASP3(PDB ID:6CI0)、MYC(PDB ID:6C4U)、VEGFA(PDB ID:4WPB)蛋白均從PDB(http:/ /www.rcsb.org)網(wǎng)站獲取。活性口袋大小均設(shè)置為x=15,y=15,z=15。Affinity 代表親和力,親和力越小代表相互作用越強。

2 結(jié)果

2.1 土茯苓活成成份篩選

使用TCMSP 共篩選出15 個活性成份,如表1所示。其中落新婦苷已經(jīng)被證明可以抑制白介素1β(IL-1β)、IL-6 mRNA 的表達(dá)[18],增加 IL-10 的釋放[19],減少細(xì)胞凋亡的作用[20]。β-谷甾醇可以增強機體氧自由基(OFR)的清除能力,提升血清NO含量,抑制腫瘤壞死因子(TNF-α) 的聚集與釋放[21-22]。柚皮素可以抑制 NF-κB 途徑的炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)的釋放,抑制TNF-α 的分泌和肺嗜中性粒細(xì)胞浸潤[23]。豆甾醇同樣能抑制NF-κB 通路[24],減少由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的環(huán)氧化酶-2(COX-2)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 的表達(dá),同時通過減少 PGE2和 NO 的釋放[25]。槲皮素可以抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iN-OS)、環(huán)氧化酶 2(COX-2)和 C 反應(yīng)蛋白(CRP)的水平[26]。薯蕷皂苷元可通過抑制酪氨酸激酶2(CK-2),激活JNK、NF-κB 和轉(zhuǎn)錄激活因子(AP-1),減少巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(ROS)、IL-1 和IL-6 等炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用[27]。

2.2 土茯苓活性成份的核心成份

使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選土茯苓活性成份靶點并使用uniprot 逐一輸入轉(zhuǎn)換為基因Symbol,其中落新婦苷未查詢到靶點,新落新婦苷、異黃杞苷未查詢到基因Symbol,最終得到12 個活性成份的145 條基因Symbol。使用genecard 獲取疾病相關(guān)基因,其中細(xì)菌性肺炎2484 條、急性扁桃體炎9137 條、急性下尿路感染3977 條、外陰陰道炎106 條、細(xì)菌性腹瀉2556 條。分別對藥物靶點與疾病靶點取交集,摘出靶點對應(yīng)的藥物活性成份,發(fā)現(xiàn)土茯苓活性成份中有5 個分別對五種疾病均起作用,分別為柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元、豆甾醇,如圖1 所示,將此5 個成份視為土茯苓治療發(fā)熱的核心成份。

圖1 土茯苓活性成份與五種疾病的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of the active ingredients of glabrous greenbrier rhizome and five diseases

表1 土茯苓活性成份Table 1 Active ingredients of glabrous greenbrier rhizome

2.3 土茯苓-靶點-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)

土茯苓-靶點-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)如圖2 所示,共有111 個節(jié)點,460 條邊?；诰W(wǎng)絡(luò)的 Degree 值和Betweenness Centrality 值發(fā)現(xiàn)成份中同樣為柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元、豆甾醇的值最高,為核心成份。靶點中 PTGS1、PGR、RELA、NR3C2、AKR1B1 的值 Degree 值和 Betweenness Centrality 值最高,但靶點蛋白并不是單獨存在的,蛋白與蛋白之前在體內(nèi)存在著互相作用,并不能單以靶點在網(wǎng)絡(luò)中的連接個數(shù)判斷靶點蛋白的重要性,為更準(zhǔn)確探索網(wǎng)絡(luò)中靶點之間的相互作用,進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

2.4 土茯苓-疾病 PPI 網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞活性和功能的執(zhí)行者,并不是獨立存在的,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用在生命過程的各階段及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。為了解析土茯苓-疾病靶蛋白的互相作用方式,提取土茯苓靶點與五種疾病基因的交集信息,構(gòu)建了土茯苓-疾病靶蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò),如圖3所示。根據(jù) Degree 值和 Betweenness Centrality 值發(fā)現(xiàn) IL-6、EGFR、CASP3、MYC、VEGFA 在土茯苓-疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)中起到了重要作用。其中,IL-6 是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,參與炎癥反應(yīng)的多種過程,CASP3 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者,下調(diào)可顯著減少炎癥損傷程度[28]。EGFR 能抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷,有助于降低炎癥反應(yīng)[29-30]。MYC可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡,同樣與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[31]。VEGFA 可調(diào)低炎癥因子 IFN-γ,IL4 和IL17 A 的表達(dá),從而減少炎癥的發(fā)生[32]。

2.5 GO 和 KEGG 富集分析

為進(jìn)一步探索土茯苓-疾病靶點在體內(nèi)生物過程的作用,將靶基因進(jìn)行GO-BP 和KEGG 富集,如圖4 所示。GO-BP 中 response to xenobiotic stimulus是指由于外來生物的復(fù)合刺激導(dǎo)致細(xì)胞或有機體的狀態(tài)或活動(如運動、分泌、酶的產(chǎn)生、基因的表達(dá)等)發(fā)生變化的過程。由于感染多由于細(xì)菌、病毒等外源病原體侵襲所致,所以土茯苓所調(diào)控的基因在機體對外界反應(yīng)過程可能存在著重要的作用。KEGG 中 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 通路提示土茯苓可調(diào)節(jié)是EGFR 抑制劑的耐藥[33],在前面已經(jīng)提到調(diào)低EGFR 可減少炎癥的發(fā)生,而此處KEGG 富集結(jié)果進(jìn)一步證明了土茯苓可能還有使已耐藥的EGFR 抑制劑敏化的作用。

圖2 土茯苓-靶點-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Glabrous greenbrier rhizome-target-gene-disease network

2.6 土茯苓核心成份-靶點分子對接

以上研究已經(jīng)證明了土茯苓治療感染性疾病的核心成份為柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元和豆甾醇,其主要作用的功能蛋白為IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和VEGFA。但結(jié)果均基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的模擬,有待驗證。為進(jìn)一步明確已得結(jié)論,采用分子對接方法分別使用柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元和豆甾醇與 IL-6、EGFR、CASP3、MYC和VEGFA 進(jìn)行對接驗證,如圖5 所示。除薯蕷皂苷元與CASP3 對接的親和力較弱之外,其他所有分子均可與靶蛋白以強親和力對接。

圖3 土茯苓-疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Glabrous greenbrier rhizome-disease PPI network

圖4 GO-BP 和 KEGG 分析Figure 4 GO-BP and KEGG analysis

圖5 土茯苓核心成份與靶蛋白分子對接Figure 5 Interaction of glabrous greenbrier rhizome with core components and target protein molecules

3 討論

3.1 土茯苓治療發(fā)熱的理論基礎(chǔ)

土茯苓出自《滇南本草》,味甘、淡,性平。有解毒,健脾除濕,通利關(guān)節(jié)之功效。王烈教授認(rèn)為土茯苓退熱之功有三,一為健脾退熱:土茯苓具有健脾之功,脾為后天之本,脾健則水谷精微充足,宗氣旺盛,正氣充沛則驅(qū)邪有力,再則脾為肺之母,脾健則肺氣充沛,呼吸有力,氣有所運,衛(wèi)有所固,外邪難以侵入。二為除濕退熱:濕本黏滯重濁易化熱,土茯苓本具“祛濕熱,利筋骨”之功,王烈教授根據(jù)數(shù)十年臨床經(jīng)驗,擴大了土茯苓的治療范圍,認(rèn)為土茯苓全身之濕熱都可除之,不僅關(guān)節(jié)而。三為益氣退熱:土茯苓又叫白余糧,本為充饑之食物,可為人體提供能量所需,使脾胃有所運化,為氣血津夜的化生的物質(zhì)基礎(chǔ),能補充人體精微物質(zhì),提升正氣以祛邪退熱?？傊?王烈教授認(rèn)為兒童發(fā)熱性疾病,無論何種原因引起,都可用土茯苓退熱,且效如桴鼓。

3.2 土茯苓治療發(fā)熱的物質(zhì)基礎(chǔ)和主要靶點

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫以O(shè)B＞30%和DL＞0.18 為指標(biāo)篩選土茯苓的分子成份,初步篩選出15個主要成份。15 個成份對應(yīng)的靶蛋白輸入uniprot矯正后得到了12 個成份的145 個基因Symbol。進(jìn)一步使用genecard 獲取疾病基因與土茯苓成份進(jìn)行交集后構(gòu)建土茯苓-靶點-基因-疾病網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元、豆甾醇的Degree值和Betweenness Centrality 值最高,為土茯苓的核心成份。PPI 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn) IL-6、EGFR、CASP3、MYC、VEGFA 為土茯苓治療發(fā)熱的核心靶點,使用靶點富集GO 分析的生物過程發(fā)現(xiàn)response to xenobiotic stimulus 為主要的富集通路,KEGG 富集發(fā)現(xiàn)土茯苓可能還有使已耐藥的EGFR 抑制劑敏化的作用。最后,為了對已得出的結(jié)論進(jìn)一步驗證,使用柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元和豆甾醇分別與IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和 VEGFA 進(jìn)行分子對接,成功驗證了成份與靶點的親和力?？傊?我們的研究認(rèn)為土茯苓治療發(fā)熱的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蕷皂苷元和豆甾醇,主要靶點為IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和 VEGFA。

3.3 發(fā)熱有益還是有害

由于復(fù)雜的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了熱源性細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6、TNF-α 的大量合成、釋放和堆積[34],進(jìn)而導(dǎo)致熱性驚厥、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、殘疾甚至死亡的發(fā)生,發(fā)熱一直被認(rèn)為是威脅健康的癥狀或疾病。然而,現(xiàn)代研究同樣證明了熱源性細(xì)胞因子堆積的同時,先天免疫反應(yīng)也會被迅速激活,進(jìn)而消滅病原體,發(fā)熱毫無疑問也是人體免疫機制的重要組成部分[35]。關(guān)于發(fā)熱對人體有益還是有害的爭論似乎從未停止[36]。本研究基于中醫(yī)理論認(rèn)為“火者,陽氣也”、“少火之氣壯…少火生氣”、“人非此火,不能生養(yǎng)命根”,認(rèn)為在五行生克制化范圍內(nèi)的火氣,偏于補充人體陽氣,能溫陽周身,助人抗邪,實屬大善。但《內(nèi)經(jīng)知要》也云:“但陽和之火則生物,亢烈之火反害物,故火太過則氣反衰,火和平則氣乃壯”,認(rèn)為平和之火可增強人體正氣,增加對病邪的抵抗力?？毫抑鸩粌H對人體無益,反而耗氣傷津,加重病情,故臨床仍需分辨平和之火和亢烈火。具體在發(fā)熱病癥中,本研究認(rèn)為患病過程中維持一定體溫對抗邪有益無害,只要控制恰當(dāng),不產(chǎn)生熱性驚厥、神經(jīng)損傷等并發(fā)癥,發(fā)熱的效果或可優(yōu)于使用針?biāo)帯?/p>