HPVE6/E7mRNA聯合P16Ki-67預測低級別宮頸鱗狀上皮的臨床價值評估

江強

【摘要】 目的：探討HPVE6/E7mRNA聯合P16Ki-67預測低級別宮頸鱗狀上皮的臨床價值。方法：選取2017年1月-2019年4月在本院進行婦科檢查的低級別宮頸鱗狀上皮病變患者220例，以宮頸病理學為標準，對患者進行HPVE6/E7mRNA檢測、P16Ki-67雙染色及聯合檢測，比較P16Ki-67與HPVE6/E7mRNA的陽性檢測率以及單一檢測與聯合檢測對高級別宮頸鱗狀上皮病變及以上患者的診斷效能。結果：HPVE6/E7mRNA宮頸炎、LSIL檢測陽性率分別為13.64%、22.34%，P16Ki-67宮頸炎、LSIL檢測陽性率分別為4.55%、10.64%，兩組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。HPVE6/E7mRNA HSIL、宮頸癌檢測陽性率分別為80.00%、100%，P16Ki-67 HSIL、宮頸癌檢測陽性率分別為77.14%、100%，兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）。聯合檢測靈敏度明顯高于單一檢測，比較差異有統計學意義（P<0.05），且聯合檢測約登指數較高，且特異性較高，其綜合性最強。結論：HPVE6/E7mRNA聯合P16Ki-67能夠更好預測低級別宮頸鱗狀上皮病變的進展，且針對高級別宮頸病變具有更強的敏感性，減少陰道鏡轉診率，有效避免了因短暫性HPV感染的過度治療，從而降低了監測以及治療成本。

【關鍵詞】 HPVE6/E7mRNA檢測 P16Ki-67檢測 低級別宮頸鱗狀上皮病變

Evaluation of Clinical Value of HPVE6/E7mRNA Combined with P16Ki-67 in Predicting Low Grade Cervical Squamous Epithelium/JIANG Qiang. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： 0-067

[Abstract] Objective： To investigate the clinical value of HPVE6/E7mRNA combined with P16Ki-67 in the prediction of low grade cervical squamous epithelium. Method： From January 2017 to April 2019 in our hospital of department of gynaecology the less of cervical squamous epithelial lesions of 220 cases were selected. On the basis of cervical pathology，they were given HPVE6/E7mRNA test， P16Ki-67 double staining and joint detection. P16Ki-67 with HPVE6/E7mRNA positive detection rate， and a single detection with joint detection in patients with high level cervical squamous epithelial lesions and above diagnostic efficiency of patients were compared. Result： The positive rates of HPVE6/E7mRNA cervicitis and LSIL were 13.64% and 22.34%， respectively， the positive rates of P16Ki-67 cervicitis and LSIL were 4.55% and 10.64%， respectively， with significant differences between the two groups （P>0.05）. The positive rates of HPVE6/E7mRNA HSIL and cervical cancer detection were 80.00% and 100%， respectively， the positive rates of P16Ki-67 HSIL and cervical cancer detection were 77.14% and 100%， respectively， with no statistical difference between the two groups （P>0.05）. The sensitivity of the combined test was significantly higher than that of the single test， with a significant difference （P<0.05）. Moreover， the combined test had a higher Yoden index， higher specificity， and the most comprehensive. Conclusion： HPVE6/E7mRNA combined with P16Ki-67 can better predict the progress of low grade cervical squamous lesions， and has a stronger sensitivity for high grade cervical lesions， reduce the colgoscopy referral rate， effectively avoid over treatment due to transient HPV infection， thereby reducing the monitoring and treatment costs.

[Key words] HPVE6/E7mRNA detection P16Ki-67 detection Low grade cervical squamous epithelial lesions

First-authors address： Taian Cancer Prevention and Treatment Hospital， Taian 271000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.017

宮頸癌發病率在婦女惡性腫瘤位居第二，據相關統計全世界每年大約有50萬女性罹患宮頸癌，我國每年約新增宮頸癌患者13萬例，約占全球1/3發病量[1-2]。據相關研究顯示，宮頸癌以及癌前病變均與HPV感染有關[3]。而相關學者進一步的研究發現，宮頸上皮內瘤變并非一種程度不同連續的單一病變，而是具有明顯差異的兩類不同臨床病理過程，臨床將其分為低級別鱗狀上皮病變和高級別鱗狀上皮病變[4]。低級別鱗狀上皮病變是致癌性或者非致癌性HPV感染的組織病理學表現，臨床主要通過隨訪為主;而高級別病變則被認為癌變病變，此類患者通常需要通過手術進行治療。而臨床對于低級別鱗狀上皮病變的診斷具有一定難度，因缺乏客觀依據，通常會導致診斷結果出現偏差，從而出現漏診或過度治療，因此提高低級別宮腔鱗狀上皮病變準確性具有重要的臨床價值。文獻[5-6]顯示，HPVE6/E7mRNA與P16Ki-67檢測在低級別宮腔鱗狀上皮病變的評估中均有一定的臨床價值，但對于二者聯合預測低級別宮腔鱗狀上皮病變的研究較為罕見，需進一步探討。本研究旨在通過對低級別宮腔鱗狀上皮病變患者使用HPVE6/E7mRNA聯合P16Ki-67檢測，評估二者聯合在預測低級別宮腔鱗狀上皮病變的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月-2019年4月在本院進行婦科檢查，經TCT檢測為低級別宮頸鱗狀上皮病變患者220例，年齡21～62歲，平均（40.43±4.61）歲。納入標準：有性生活史，在入院前3 d未進行陰道沖洗或用藥;排除妊娠、HIV感染或者免疫缺者，有子宮腔疫苗接種、盆腔手術、子宮頸病變的治療史。本研究患者均知情同意并簽署知情同意書，同時獲得本院倫理委員會的批準下進行。

1.2 方法 所有患者均先行TCT檢測，之后進行P16Ki-67免疫細胞化學雙染色檢測以及HPVE6/E7mRNA檢測。標本的采集：分別采集每位患者宮頸標本2份。取膀胱截石位，窺陰器暴露宮頸，使用無菌鹽水棉球拭去宮頸口多余分泌物以及黏液，將宮頸刷置于宮頸口順時針旋轉5周后取出，將標本放入相對應的取樣試管中進行相應的檢測。P16Ki-67免疫細胞化學雙染色檢測方法：（1）制作液基細胞學基片，將其用950 mL/L酒精固定20 min，使其自然干燥;（2）在免疫組織化學染色儀中進行P16Ki-67雙染色檢測;（3）設置陽性與陰性對照：即P16核呈現棕黃色或者胞質及核均為棕黃色，且在同一個細胞內Ki-67核呈現棕紅色則為陽性，其他則為陰性[7]。HPVE6/E7mRNA檢測方法：（1）離心處理后棄去上清液，使標本同質化;（2）在沉淀細胞團中加入200 μL的裂解液與400 μL DDH2O，混合后再加入5 μL蛋白酶K，在65 ℃環境中孵育60 min;（3）配置空白以及陽性質控緩沖液2份，每份98 μL，標本反應體系50 μL;（4）使用含特殊捕獲探針的96孔板常溫復溫后，進行雜交捕獲mRNA;（5）按照3︰1 000比例配置底物催化劑與底物的混合液，將96孔板取出，棄置標記探針混合液，IX洗脫液洗板3次，200 μL/次，每孔加入混合液100 μL，封板后置于46 ℃恒溫箱反應20 min后判斷結果;（6）HPVE6/E7mRNA拷貝數>1 copy/mL為陽性，反之為陰性[8]。組織病理學檢測：為能夠準確評估檢測方法的特異性，本研究對所有患者進行陰道鏡下子宮頸活檢，其結果分為低級別宮腔鱗狀上皮（LSIL）及以下病變：宮頸炎及CINⅠ，高級別宮腔鱗狀上皮（HSIL）及以上病變，CINⅡ、CINⅢ以及宮頸癌。

1.3 統計學處理 本研究數據采用SPSS 19軟件包進行統計學處理，計量資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗，一致性采用Kappa值衡量，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織病理學結果 220例患者中宮頸炎88例（40.00%），LSIL為94例（42.73%），HSIL為35例（15.91%），宮頸癌為3例（1.36%）。

2.2 P16Ki-67與HPVE6/E7mRNA的宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸癌檢測情況比較 HPVE6/E7mRNA宮頸炎、LSIL檢測陽性率分別為13.64%、22.34%，P16Ki-67宮頸炎、LSIL檢測陽性率分別為4.55%、10.64%，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。HPVE6/E7mRNA HSIL、宮頸癌檢測陽性率分別為80.00%、100%，P16Ki-67 HSIL、宮頸癌檢測陽性率分別為77.14%、100%，比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 P16Ki-67檢測、HPVE6/E7mRNA檢測及聯合檢測對HSIL診斷效能比較 聯合檢測靈敏度明顯高于單一檢測，比較差異顯著（P<0.05），且聯合檢測的約登指數較高，但三者比較無顯著差異（P>0.05）。見表2～5。

3 討論

宮頸癌是危害女性健康的惡性腫瘤之一，近幾年隨著宮頸細胞學篩查技術的發展，逐漸普及于臨床后，使宮頸癌的發生率與死亡率得到明顯改善。研究顯示，低級別宮頸鱗狀上皮病變在臨床診斷中具有相當大的挑戰，與觀察者之間重復性較差及過度診斷有關，導致低級別宮頸鱗狀上皮病變在治療中存在較多的分歧[9-10]。相關學者研究發現，約15%的低級別宮頸鱗狀上皮病變可能會發展為宮頸癌。在低級別宮頸鱗狀上皮病變中，HPV高感染率現狀導致DNA的分流能力受到影響，若將所有感染HPV的低級別宮頸鱗狀上皮病變患者轉為陰道鏡檢查會給患者帶來較大的經濟壓力及心理負擔[11-12]。因此如何將有進展性的高危患者從大量暫時性感染人群中分流出來成為當務之急。文獻[13]顯示，HPVE6/E7致癌基因的表達是HPV感染與高級別宮頸鱗狀上皮病變進展的一項重要標志。HPVE6/E7致癌基因的上調降解了p53及pRb蛋白，解除細胞周期，最終形成子宮頸癌[14]。

本研究顯示，220例低級別宮頸鱗狀上皮病變患者通過組織病理進一步檢測，其中炎癥患者占40%，低級別宮頸鱗狀上皮病變患者占42.73%，高級別宮頸鱗狀上皮病變患者占15.91%，宮頸癌患者占1.36%。使用HPVE6/E7mRNA檢測其炎癥、低級別宮頸鱗狀上皮病變、高級別宮頸鱗狀上皮病變及宮頸癌陽性率分別為13.64%、22.34%、80.00%、100%，而P16Ki-67雙染色檢測在上述病變中的陽性率分別為4.55%、10.64%、77.14%、100%。由此可見，隨著患者病變程度的加重，兩種檢測方法檢測陽性率隨之增加。而在炎癥與低級別宮頸病變中，HPVE6/E7mRNA檢測陽性率明顯高于P16Ki-67，而在高級別病變與宮頸癌中，兩種檢測陽性率則無顯著差異，與相關文獻[15]結論一致。

另有學者研究發現，HPVE6/E7mRNA出現的時間要早于P16Ki-67，特別是在宮頸病變較輕的組織中表現較為明顯，而在病變較為嚴重的組織中，HPVE6/E7mRNA與P16Ki-67則幾乎同時表達[16-17]。文獻[18]顯示，P16Ki-67雙染色檢測可有效提高宮頸癌的準確性，并且對于在低級別宮頸上皮病變中的分流診斷中有重要價值。國外則有報道認為HPVE6/E7mRNA可有效提高宮頸癌篩查的效能，同時可彌補TCT檢測的不足[19-20]。

本研究通過分析HPVE6/E7mRNA、P16Ki-67及二者聯合檢測在低級別宮頸病變患者的分流效果進行評估，筆者以組織病理學為診斷結果的金標準。結果顯示，聯合檢測診斷高級別宮頸病變以上的靈敏度明顯高于單一檢測，且聯合檢測的約登指數最高，說明聯合檢測的真實性為最好。相比于HPVE6/E7mRNA、P16Ki-67單一檢測，二者聯合檢測不僅提高了診斷的靈敏度，同時也保持了較高的特異度，且綜合性最好。

綜上所述，HPVE6/E7mRNA聯合P16Ki-67能夠更好預測低級別宮頸鱗狀上皮病變的進展，且針對高級別宮頸病變具有更強的敏感性，減少陰道鏡轉診率，有效避免了因短暫性HPV感染的過度治療，從而降低了監測以及治療成本。

參考文獻

[1] Chopra S，Mittal P，Viswanathan A，et al.Global Collaborations for Cervical Cancer： Can the East-West Alliance Facilitate Treatment for all？[J].Clin Oncol （R Coll Radiol），2019，31（8）：529.-538

[2]張超瑜，譚文華，劉巍.MAPK通路在宮頸癌中的研究進展[J].國際遺傳學雜志，2019，42（1）：69-74.

[3]田凌君，吳素慧，李雪，等.HPV與宮頸癌及癌前病變的研究進展[J].中國醫師雜志，2017，19（9）：1437-1440.

[4]常小壘，郭科軍，張頤.HPV亞型與子宮頸癌前病變及癌變的關系探討[J].中國醫科大學學報，2015，43（8）：720-723.

[5]潘嬙微，鄭小冬，沈曉露，等.不同年齡高危HPVE6/E7mRNA檢測在ASC-US分流中的應用[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2016，30（1）：45-49.

[6] ?ekoranja D，Rep?e-Fokter A.Triaging Atypical Squamous Cells-Cannot Exclude High-Grade Squamous Intraepithelial Lesion With p16/Ki67 Dual Stain[J].Journal of Lower Genital Tract Disease，2017，21（2）：108-111.

[7]許麗俐，陳明雄，成瑜，等.P16、Ki67蛋白在TCT檢查陽性患者中的表達及其意義[J].醫學臨床研究，2018，35（10）：2021-2022.

[8]蔣欣，張亞軍，江月，等.高危HPVE6/E7mRNA與HPV DNA檢測對宮頸病變診斷及風險評估的價值[J].廣東醫學，2018，39（S2）：138-141，145.

[9] Ciavattini A，Serri M，Giuseppe J D，et al.Long-term observational approach in women with histological diagnosis of cervical low-grade squamous intraepithelial lesion： an Italian multicentric retrospective cohort study[J].BMJ Open，2019，9（7）：e024920.

[10] Jianhua Liu，Zhitao Lu，Guili Wang，et al.Viral load and integration status of HPV58 associated with cervical lesion severity in women of Northeast China[J].Japanese Journal of Clinical Oncology，2017，47（2）：123-129.

[11]李曉林，畢淑娜，范俊，等.hrHPVE6/E7mRNA用于宮頸癌機會性篩查的臨床價值[J].現代婦產科進展，2017，26（1）：44-48.

[12]蔣欣，張亞軍，江月，等.高危HPVE6/E7mRNA與HPVDNA檢測對宮頸病變診斷及風險評估的價值[J].廣東醫學，2018，39（z1）：132-135，139.

[13] Li Y，Rong S，Zhi Y，et al.Detection of cervical intraepithelial neoplasia with HPVE6/E7 mRNA among women with atypical squamous cells of unknown significance[J].International Journal of Gynecology & Obstetrics，2017，137（2）：145-149.

[14]葉建紅，陳雪紅，包麗麗，等.HPVE6/E7mRNA及HPVL1蛋白表達與宮頸病變的關系及其診斷價值[J].中國婦幼健康研究，2018，29（2）：170-173.

[15]王丹，李一春，劉霞，等.人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA表達聯合液基薄層細胞學檢測對宮頸癌早期篩查和診斷的意義[J].中國婦幼保健，2017（24）：6147-6150.

[16] Ye-li YAO， Qi-fang TIAN， Bei CHENG， et al.Human papillomavirus（HPV） E6/E7 mRNA detection in cervical exfoliated cells：a potential triage for HPV-positive women[J].

J Zhejiang Univ Sci B，2017，18（3）：256-262.

[17] Ahmed S T，Ahmed A M，Musa D H，et al.Proliferative Index （Ki67） for Prediction in Breast Duct Carcinomas[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2018，19（4）：955-959.

[18] Rokita W，Skawiński D，Zmelonek-Znamirowska A，et al.

Results of pap smears and immunocytochemical detection of the p16 and Ki67 proteins in women with cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer[J].Ginekologia Polska，2012，83（11）：822-826.

[19] Hye-Young Wang，Sunyoung Park，Sunghyun Kim，et al.Use of hTERT and HPV E6/E7 mRNA RT-qPCR TaqMan assays in combination for diagnosing high-grade cervical lesions and malignant tumors[J].American Journal of Clinical Pathology，2015，143（3）：344-351.

[20] Basu P，Banerjee D，Mittal S，et al.Sensitivity of APTIMA HPV E6/E7 mRNA test in comparison with hybrid capture 2 HPV DNA test for detection of high risk oncogenic human papillomavirus in 396 biopsy confirmed cervical cancers[J].Journal of Medical Virology，2016，88（7）：1271-1278.

（收稿日期：2019-12-02） （本文編輯：周亞杰）