檳榔芋軟腐病生防真菌的篩選

董曉菲 葉祖云 劉雨虹 黃林榕 李珊

摘要：[目的]以福鼎檳榔芋為研究對象篩選生防菌株，為檳榔芋軟腐病生物防治提供可用菌株。[方法]從福鼎檳榔芋根際土壤和健康植株球莖內分離得到12株真菌，經離體球莖試驗篩選，共篩選出9株對檳榔芋軟腐病具有防治效果的真菌菌株。對這9株菌株進行分子鑒定、常規形態特征觀察、生理生化測定和田間活體防效等，進一步篩選可用菌株。[結果]得到2株有較好防治效果的菌株CAF-H001和CAF-L002.擴增菌株的ITSl/ITS4DNA，經測序后與NCBI數據庫進行同源性比對，結果顯示菌株CAF-H001與藤倉鐮刀菌（Fusariumfujikuroi）相似度100%，菌株CAF-L002與塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）相似度100%。其中，菌株CAF-H001為白色菌體，細長型分生孢子，最適pH為9，最適溫度為28℃，以淀粉作為碳源、蛋白胨作為氮源時生長最佳;菌株CAF-L002為黑褐色菌體，球形分生孢子，最適pH為8，最適溫度為32℃，以淀粉作為碳源、酵母浸粉作為氮源時生長最佳。[結論]本研究分離鑒定的菌株CAF-H001和CAF-L002分別為藤倉鐮刀菌和塔賓曲霉，具有較好的生防應用價值，為檳榔芋軟腐病的生物防治提供了基礎。

關鍵詞：檳榔芋;軟腐病;生物防治

中圖分類號：S436.32文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）05-0538-07

0 引言

（研究意義）檳榔芋（Colocasia esculenta L var.coFmos～Is Chang）屬天南星科多年生單子葉宿根性草本植物，營養豐富，有較高的市場價值。2011年11月22日，中華人民共和國農業部批準對“福鼎檳榔芋”實施農產品地理標志登記保護。目前檳榔芋產業已成為福建省福鼎縣農業增收的支柱產業，種植面積超過2000hm²，產值逾3億元。軟腐病是影響檳榔芋產量的最主要因素之一，株發病率一般為3%～15%，嚴重時超過50%甚至絕收，非常挫傷芋農積極性。軟腐病菌為細菌，多在檳榔芋球莖或葉柄基部發病，病菌于土壤或球莖中越冬，通過傷口、氣孔侵入，經昆蟲接觸或灌溉流水蔓延造成再次侵染，25-30℃時最易發病，暴風雨、高溫高濕、連作地等極易傳播，發病嚴重，對檳榔芋的產量和當地經濟造成巨大影響，且用輪作、化學殺菌劑等方式防治收效甚微、作用時間短，化學防治方法易產生環境安全和食品安全的隱患。（前人研究進展）生物防治高效且無毒，可有效保留環境里的有益微生物，符合人們對綠色食品的需求，且利于農業的可持續發展。利用有益微生物可有效控制病害，目前已有對黃瓜、柑橘、甜瓜等作物的病害進行微生物防治的研究。周麗洪等分離鑒定了3株內生菌對魔芋細菌性軟腐病具有顯著防控作用的生防菌株，其田間生物防治效果可達57%～79%。目前檳榔芋軟腐病的防治主要采取綜合防治技術，即農業栽培、物理人工、化學藥劑防治相結合，偏向于防重于治。（本研究切入點）關于檳榔芋軟腐病生物防治方面的研究尚比較缺乏。（擬解決的關鍵問題）本試驗在前期分離鑒定軟腐病病原菌的基礎上進一步篩選生防菌株，探究其作用效果和使用方法，以期為檳榔芋軟腐病的防治提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品：土樣和健康檳榔芋球莖均采自福建省福鼎市貫嶺鎮河坑村檳榔芋種植田地（120°1144"E，27°22′16”N），選取不同種植地塊，在地塊靠中心處，用高溫滅菌過的小鏟和剪刀進行取樣，其中土樣取深度10～15cm的健康檳榔芋植株根際土壤3處各200g，健康檳榔芋球莖5棵，分別裝入自封袋并做標記，放人裝有冰袋的泡沫箱中帶回實驗室4℃保存，并于3天內使用。檳榔芋軟腐病病原細菌來源于實驗室前期分離鑒定菌株（菌株編號141108）。

主要試劑：PDA培養基，NA培養基，0.1%升汞，75%酒精，棉蘭染液等。

儀器：生化培養箱（上海齊欣，KLH-250FD），PCR儀（德國，Biometra），超凈工作臺（蘇州凈化，SW-CJ-2D），電泳儀（北京六一，DYY-10C），超純水器（香港力康，Easyl5），高壓滅菌鍋（美國致微，GR60-DA），生物顯微鏡（寧波舜宇，E5）等。

1.2 試驗方法

1.2.1真菌的分離純化 參考方中達的方法。土壤分離真菌：稱取10g土壤放人盛有90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，依次稀釋成10^-1、10^-2、10^-3、10^-1、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀釋液。分別吸取上述稀釋液100uL均勻涂于PDA培養基平板上，每個濃度梯度涂3皿，于28℃恒溫箱倒置培養3～5d，每天觀察生長情況。內生菌分離真菌：將健康的檳榔芋球莖洗凈后切取成5×5×5cm組織塊，75%酒精浸泡1min，無菌水漂洗，再用0.1%升汞表面消毒1-2min，用無菌水沖洗3次后晾干。用無菌刀將表面消毒后的組織塊切成約0.5×0.5×0.5cm的小塊，分別置于無菌研缽中加5mL無菌水研磨成漿狀，靜置10min，將組織研磨液梯度稀釋10～1000倍，分別取100uL涂布到PDA培養基平板上，每個稀釋度涂布3皿，于28℃恒溫箱倒置培養3～5d，每天觀察生長情況。待長出菌落后，根據菌落形態、顏色等性狀將不同的單菌落挑出，采用平板劃線法在PDA培養基上進行分離純化，純化2～3次，直至分離出單菌落，于斜面試管4℃冰箱保藏。

1.2.2生防菌的離體球莖篩選 參考陳嬌梅等的方法略有改動。將分離純化的真菌和軟腐病病原細菌分別接種于PDA、NA液體培養基中，真菌于28℃、220r·min^-1搖床培養3d，病原細菌于37℃、220r·min^-1搖床培養8h，備用。選取健康檳榔芋球莖，洗凈并風干后，切取大小為長3cm×3cm×0.7cm的組織塊，75%酒精消毒30s后用0.1%升汞液消毒5min，無菌水充分滌蕩5次，再放人有濾紙的無菌培養皿中，每皿放人一組織塊，備用。將軟腐病病原菌液和待測真菌液以1：1比例混合，用無菌刀和鑷子在處理的組織塊中央劃長1cm、寬1cm、深約0.3cm的十字傷口，接種20uL混合菌液于組織塊十字中央。以無菌水接種為陰性對照，軟腐病病原菌液接種為陽性對照，每個真菌處理重復3皿，置于28℃恒溫培養箱培養14d，觀察記錄并拍照。