野生建蘭根際與根內共生細菌種群結構差異分析

謝泰祥 張清華 周杰 陳娟 馬山虎 艾葉

摘要：[目的]比較野生建蘭根際和根內細菌的種群結構差異，為研究根共生細菌與建蘭的營養關系奠定理論基礎。[方法]采用高通量測序技術鑒定福州鼓山野生建蘭根際和根內共生細菌，分析其種類多樣性和種群結構。[結果]建蘭根際、根內擁有種類多樣的細菌，辛普森指數分別為0.99、0.95;香農指數比較顯示建蘭根際細菌種類多樣性顯著高于根內。建蘭根際擁有10門細菌，優勢門為變形菌門（60。5%）、酸桿菌門（20.5%）、放線菌門（15.3%），根內優勢細菌門分別為變形菌門（75.3%）、酸桿菌門（7.3%）、放線菌門（14.6%）。根際與根內豐度最高的10個細菌屬中，Solibacter、Acidipila僅在根際中，戴氏菌、新鞘氨醇菌和Granulicella僅存在于根內。根際中酸桿菌門酸桿菌綱的豐度顯著高于根內，11個差異顯著的目，僅腸桿菌目在根內的豐度大于根際，根際有12個屬的豐度顯著高于根內。[結論]建蘭根際與根內細菌種類豐富度存在顯著性差異，其原因可能是不同生態位的細菌對建蘭的生物學功能存在較大差異。

關鍵詞：建蘭;根際細菌;根內生細菌;種群結構;種類多樣性

中圖分類號：Q93;S682.31文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）05-0560-09

0 引言

（研究意義）建蘭（Cymbidium ens沁Bum）隸屬于蘭科蘭屬，為多年生草本植物。建蘭具有極高的觀賞與文化價值，被譽為國蘭七大類之一。現有研究表明，蘭科植物共生菌根真菌在蘭花種子萌發、植株生長發育過程中起著重要的作用。蘭科植物的菌根屬于內生菌根類，其最大的特征就是菌根真菌在蘭科植物原球莖細胞內或成年植物根部皮層細胞內形成特殊的菌絲團結構，為蘭科植物生長提供必要的營養元素。因此，在現代菌根類型中，蘭科植物的共生菌根真菌被獨立地劃分為：蘭科菌根。除此之外，蘭科植物還存在豐富的共生細菌，本試驗研究建蘭根共生細菌的種類多樣性和種群結構對于揭示共生細菌與建蘭的營養關系，指導人工繁育技術滿足建蘭市場需求以及保護野生建蘭資源具有重要的意義。（前人研究進展）蘭科共生細菌在蘭花的生長發育過程中也起到重要的作用，它們可以通過產生生長素類物質、促進礦物質吸收、光合作用等機制促進蘭科植物的生長。已有的研究發現，從春蘭Cvrubidium goeringii根部分離獲得多個根瘤菌屬（Rhizobium）的細菌種類，能直接產生IAA生長激素刺激植物生長。吳慶珊等利用不同培養基對金釵石斛Dendrobium nobile不同部位進行分離培養，獲得芽孢桿菌屬（Bacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）為優勢屬，Bacillussubtilissubsp.sub～lis和Brevibacillus invocatus為優勢種，且根內生細菌豐富度明顯高于其他部位。同時研究者在對石斛屬（Dendrobium）種子進行體外共生萌發實驗，藍細菌門（Cyanobacteria）、根際細菌（Rhizobacteria）在不添加菌根真菌的條件下能刺激種子體外共生發芽。同時從建蘭根內分離出來的真菌有鐮刀菌屬Fusarium、肉座菌屬Hypocrea、小球腔菌屬Leptosphaeria、曲霉屬Aspergillus等真菌。（本研究切入點）目前從蘭科植物中發現的細菌已經超過60個屬，分布最為廣泛的主要種類有革蘭氏陽性菌的芽孢桿菌（Bacillus）和革蘭氏陰性菌的假單胞菌（Pseudomonas）;另外，鏈霉菌屬（streptomyces）、腸桿菌（Erwinia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）也是常見的蘭科植物共生細菌。但是建蘭根際以及根內共生細菌的群落結構尚未見相關研究報道。（擬解決的關鍵問題）本研究以福州市鼓嶺山脈的3叢野生建蘭為材料，基于高通量測序技術分析了建蘭根際土壤（Rhizosphere，Rhiz）及根內（Endosphere，Endo）細菌的種類多樣性、種群結構，同時比較了3叢野生建蘭根共生細菌種類的異同，篩選出共有細菌種類。研究結果將豐富人們對建蘭根際與根內細菌的認知，為建蘭人工快速繁育技術的開發提供相關理論基礎。

1材料與方法

1.1 樣品采集

樣品于2018年5月在福建省福州市鼓嶺山脈采集。隨機選擇不同位置的3叢野生建蘭居群，輕輕地將土壤表面植物殘體，以及建蘭根周圍的土壤移除，僅保留根周圍0.5cm厚度的土壤。將除去殘體和根圍土壤的建蘭根剪下，用軟毛刷刷掉附著在根表面土壤顆粒，放人50ml無菌離心管，標記為根際土壤（Rhizosphere，Rhiz），放人液氮罐中保存。

1.2 DNA提取野生建蘭根際與根內共生細菌種群結構差異分析

樣品的處理參照Edwards等人的樣品處理方法將刷掉根表面土壤顆粒的根樣品放人無菌三角瓶中，加入100ml無菌PBS緩沖液，大力將根表面的殘余土壤洗滌下來;洗滌過后的根樣品繼續加入100ml無菌PBS緩沖液，在50～60Hz（輸出頻率42kHz，功率90w，Branson Unltrasonics）上超聲波處理30s，隨后大力搖晃并重復超聲波操作處理30s;重新加入100ml無菌PBS緩沖液，重復上述超聲波洗滌工作，以確保從根表面去除所有的微生物，清洗后的根標記為根內細菌（Endosphere，Endo）。使用離心柱型土壤DNA提取試劑盒（MoBio公司）提取建蘭根際土壤總DNA;根部總DNA的提取使用天根生活科技有限公司的DP305型DNA提取試劑盒。提取的DNA經凝膠電泳檢測，合格DNA存入-80℃備用。

1.3 細菌16S區域擴增及測序

將合格的DAN樣品稀釋到1ng·uL^-1，以稀釋的DNA為模板，使用引物515F（5.-GTGCC AGCMGCCGCG GTAA-3.）和806R（5-GGACT ACHVGGGTWT CTAAT-3′）擴增細菌16S rDNA的V4區域，PCR條件為98℃30s預變性，接下來98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min.將PCR產物純化以后送至北京諾禾致源科技股份有限公司，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48ixns試劑盒（Thermofisher）構建測序文庫，并根據所擴增區域的特點，基于IonS5TMXL測序平臺，利用單端測序（Single-End）的方法，構建小片段文庫進行單端測序。

1.4 數據分析

1.4.1OTU聚類和物種注釋 使用Uparse軟件對所測序樣品的全部Clean Reads進行聚類分析，以一致性達到97%的序列聚為相同的可操作分類單位（Operational/axonomic Units，OTUs）。篩選OTUs中出現頻數最高的序列作為OTUs的代表序列。用Mothur方法與SILVA（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋（設定閾值為0.8～1.0），獲得序列指代的細菌分類地位，并在界、門、綱、目、科、屬、種水平統計樣品細菌的群落組成。

1.4.2種類多樣性分析使用Qiime 1.9.1對均一化處理后的數據進行計算，獲得各個樣品的種類數量（Observed-species）、香農指數（Shannon index）、Chaol指數、辛普森指數（Simpson index）;使用R軟件（Version2.15.3）繪制稀釋曲線，物種累積曲線。

1.4.3種群結構比較分析 對3個不同居群建蘭根際、根內細菌種群結構進行比較，篩選3個不同地點樣品的共有根際、根內細菌OTUs.根際（Rhiz）和根內（Endo）差異顯著的物種分析利用R軟件做組間T-test檢驗并作圖。

2 結果與分析

2.1測序結果評價

通過對6個樣品16S rDNA V4區域進行高通量測序共獲得430434條Clean reads，根際土壤樣品的平 均Clean reads數量為74848，根內樣品的平均Cleanreads為68599（表1），所有樣品中最低的Cleanreads為57117.通過繪制建蘭3個樣品的根際及根內細菌高通量測序結果的稀釋曲線（RarefactionCurve）檢測樣品的測序深度是否達到要求。稀釋曲線顯示，測序數據量達到50000條時，各樣品中呈現出的物種數量趨于平坦（圖1）;各樣品測序深度指數good'scoverage均等于0.998（表1）;表明該測序已經獲得足量的測序數據，能夠有效覆蓋樣品中物種數量，測序數據量合理。

2.2 建蘭根際與根內細菌種類多樣性分析

基于≥97%的相似度水平，通過聚類分析共獲得4412個有效OTU，根際土壤獲得（817±42）個OTU，多于根內共的654-4-78個OTU（表1），二者不存在顯著性差異，但是香農指數顯示根際土壤細菌的種類數量顯著高于根內細菌種類（P=0.05）。建蘭的6個測序樣品中，End04的辛普森指數（Simpson）最低為0.90，另外2個根內樣品辛普森指數分別為0.96與0.98，根際土壤的則為0.99，證明建蘭根際與根內細菌種類多樣性高（辛普森指數的范圍是0～1，越趨近于l表明種類多樣性越高）。Chaol用來判斷群落的物種豐富度，數值越大，表示物種種類越多。3個根際樣品的平均細菌Chaol指數865.43大于根內細菌的Cha01指數700.99，T-test檢驗結果顯示根際與根內細菌種群豐富度存在顯著差異（P=0.05）。

2.3 建蘭根際與根內細菌種群結構

對3叢野生建蘭根際細菌高通量測序獲得的224635條clear reads進行種類注釋，發現建蘭根際細菌主要分布在變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chlorotlexi）10個門，根際細菌的10個門含有17綱（+8個未鑒定綱），39目（+5個未鑒定目）和113個確定的屬;根內細菌有13綱（+7個未鑒定綱），37目（+2個未鑒定目）和107個確定的屬。根際細菌中變形菌門占種群數量的60.5%，為優勢門類，酸桿菌門占20.5%，放線菌門占15.3%，其余7個門類僅占3.7%。根內細菌同樣分布在上述10個門，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）分別占種群數量的75.3%、7.3%和14.6%。優勢種群的綱有酸桿菌綱（Acidobacteriia）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）、α-變形菌綱（Alpha-proteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）和一個放線菌門（Actinobacteria）未確定綱（圖2）。

根際與根內細菌群落中豐富度最高的lO個目是一致的，有一個γ-變形菌綱未定目（unidentifiedGammaproteobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），酸桿菌目（Acidobacteriales），土壤紅桿菌目（Solirubro-bacterales），棒桿菌目（Corynebacteriales），α-變形菌綱未定目（unidentified Alphaproteobacteria），柄桿菌目（Caulobacterales），弗蘭克氏菌目（Frankiales），Solibacterales，Micropepsales（圖3）。根據與根內細菌豐富度最高的屬存在明顯差別。根際細菌群落豐富度最高的10個屬分別是一個伯克氏科菌未定屬（unidentified Burkholderiaceae）、熱酸菌屬（Acidothermus）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、Roseiarcus、分支桿菌屬（Mycobacterium）、SoBbacter、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Conexibacter、Acidipila、和α-變形菌未鑒定屬（unidentified Alpha-proteobacteria）;根內細菌豐富度最高的10個屬分別是一個伯克氏科菌未定屬（unidentified Burkholderiaceae）、Conexibacter、分支桿菌屬（Mycobacterium）、熱酸菌屬（Acidothermus）、Roseiarcus、戴氏菌屬（Dyella）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、新鞘氨醇菌屬（Novosphingobium）、GranuBcella、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（圖4）。

2.4 建蘭根際與根內細菌差異分析

通過T-test檢驗，在門、綱、目、屬分類單元下找出根際與根內組間的差異物種。在P=0.05差異水平下，建蘭根際與根內僅有酸桿菌門（Acidobacteria）數量存在顯著差異;在綱分類單元下有酸桿菌綱（Acidobacteriia）差異顯著;根際與根內細菌種群存在顯著差異的目有：根瘤菌目（Rhizobiales）、酸桿菌目（Acidobacteriales）、柄桿菌目（Caulobacterales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、粘球菌目（Myxococcales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、咸水球形菌目（Salinisphaerales）、Catenulisporales和噬纖維菌目（Cytophagales），還包括一個酸桿菌門未定目（unidentified Acidobacteriia）和一個疣微桿菌門未定目（unidentified Verrucomicrobiae）。有12個屬：熱酸菌屬（Acidothermus）、醋酸桿菌屬（Acidibacter）、SoBbacter、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、酸桿菌門未鑒定屬（unidentifiedAcidobacteriia）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis）、柄細菌屬（Caulobacter）、Pedosphaera、Pajaroellobacter、嗜鹽囊菌屬（Haliangium）、Actinospica、游魚孢菌屬（Jporichthya）在建蘭根際與根內中的種群數量存在顯著差異（圖5）。

分別分析3叢不同居群建蘭的根際、根內細菌的共有種類，共篩選到根際共有OTUs 588個，根內共有OTUs 379個（圖6），其中根內共有的379個細菌OTUs中的339個同時分布在根際土壤中，僅有40個OTUs是根內特有的。分別對共有OTUs進行鑒定，根際的588個OTUs涉及到16綱39目93屬，根內的379個共有OTUs鑒定出13綱，36目，64屬;根際與根內共有的OTUs包含8門，13綱，32目60屬;根際與根內共有的40個OTUs分布在6門，7綱，14目，能確定的屬有10個，分別是雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、Protochlamydia、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、Bauldia、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium）、嗜酸菌屬（Acidiphilium）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、沙雷氏菌屬（Serratia）。

3 討論與結論

應用16S rDNA高通量測序鑒定3叢野生建蘭根際土壤（Rhiz）和根內（Endo）共生細菌的種類，結果表明建蘭根際土壤和根內都存在豐富的細菌，種類多樣性高，根際土壤細菌種類多樣性顯著高于根內細菌（P=0.05）。對其種群結構進行分析，發現根際和根內細菌種群結構中變形菌門細菌數量占絕對優勢。分析3叢不同居群建蘭的根際與根內細菌的共有OTUs，發現根內絕大多數OTUs同樣存在于根際土壤中，僅有10個屬的細菌是根內特有的。但是，差異性分析發現，根際與根內細菌種類豐富度存在顯著性差異，這可能與土壤環境較植物組織內部系統更為復雜有關。根內特有細菌主要與根內特定真菌結合形成真菌內共生細菌（EndofungalBacteriun，EFB）。EFB主要為真菌宿主提供生物能力、糖化合物和維生素等必需因子，促進真菌宿主降解有毒性氧化物質的功能，從而提高植株菌根的形成量。因建蘭種子萌發需要依靠特定的菌根真菌的侵染為其提供所需的營養，推測真菌在完成侵染后，需要特定的細菌進入根內，為真菌宿主的代謝、繁殖和抗逆性提供輔助作用，從而出現不同生態位的細菌的生物學功能出現較大差異現象。因此，研究建蘭根際和根內細菌的生物學功能對揭示根部共生細菌對建蘭生長的影響具有重要意義。

蘭科植物依其所屬生態類型可分為地生蘭、附生蘭和腐生蘭3類，建蘭屬于地生蘭，現有研究已經證實菌根真菌在促進建蘭種子萌發和植株生長方面起著重要的作用，而蘭科植物根際細菌，尤其是根內生細菌的作用也逐漸被挖掘，比如石斛屬（Dendrobium）。但是關于建蘭根共生內細菌及其與建蘭之間營養關系的研究尚未有報道。本文發現建蘭根際、根內細菌中種群數量最高的前10個屬有中分別有8、9個確定的屬。其中，短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）在根際和根內都有檢測到。該屬細菌地域分布范圍很廣，能夠與多種豆科植物形成共生關系，促進宿主N素的吸收。短根瘤菌屬在建蘭根際土壤和根內部豐富度較高，推斷該細菌在與建蘭的生長發育存在密切的聯系，短根瘤菌是否與建蘭形成共生關系，需要獲得純培養菌株并進一步接種建蘭加以驗證。很少有證據表明柄細菌屬（Caulobacter）細菌對植物有益，最新的研究發現Caulobacter sp RHGl菌株可以定殖擬南芥的根和芽，促進根中的側根形成，并增加枝條中的葉數和葉大小，該屬細菌是否促進建蘭生長根系發育需要進一步研究。明確此類細菌與建蘭的營養關系能夠為建蘭人工繁育提供有效的促生因子，但是，建蘭根際和根內存在多個目前不能培養的細菌，如Solibacter屬細菌，對于此類細菌功能的研究可利用宏基因組技術進行研究。

比較建蘭根際土壤與根內細菌種類的異同，相對豐度最高的10個屬，根際與根內細菌存在多個相同的屬，但是Solibacter和Acidipila屬僅在根際中檢測到，而戴氏菌（Dyella）、新鞘氨醇菌（Novosphingobium）和GranuBcella屬僅存在建蘭根內。在不同分類單元上，均存在豐度差異顯著的細菌類群;而且除了根內特有的細菌種類，其余顯著性差異的細菌類群都是根際細菌含量高于根內同類細菌，OTUs數量同樣顯示根際細菌的細菌數量大于根內細菌，這與土壤環境更為復雜，微生物類群更為豐富的普遍認知相一致。

綜述所述，建蘭根際土壤和根內存在種類豐富的細菌，具有極高的生物多樣性，而且根際與根內細菌種群結構存在差異，部分種類差異顯著。本研究為從建蘭根際和根內細菌中挖掘促生因子奠定了理論基礎，具有一定的指導意義。