基于mtDNACOI和mtDNACOⅡ分子標記的貴州省茶棍薊馬種群遺傳多樣性分析

羅林麗 孟澤洪 李帥 趙興麗 周羅娜 賀圣凌 周玉鋒

摘要：【目的】研究貴州省茶棍薊馬不同地理種群間的遺傳多樣性，為掌握貴州省茶棍薊馬的遺傳動態和擴散規律及制定防控措施提供理論依據。【方法】以貴州省11個不同地理區域的茶棍薊馬種群mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列為靶標，利用MEGA 6.0、DnaSP 5.10、Arlequin 3.5.2.2和Network 2.0等軟件對種群遺傳分化、基因流水平、分子變異及種群遺傳多樣性等進行分析。【結果】基于mtDNA CO I和mtDNA CO II基因分析時，分別檢測到11種和9種單倍型，各地理種群的單倍型多樣度（Hd）較高，分別為0.609和0.633;總體遺傳固定指數（FST）分別為0.11902和0.09052，基因流（Nm）分別為2.00和2.51，表明貴州省茶棍薊馬各地理種群間的基因交流水平較高，種群間遺傳分化較小。mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列的單倍型網狀樹分析均無明顯分支;種群間的分子變異（AMOVA）分析結果表明，茶棍薊馬的遺傳變異主要來自種群內部。總群體的中性檢驗Fus Fs不顯著（P>0.05），且錯配分布曲線呈現多峰，說明貴州省茶棍薊馬種群在較近的歷史時期內保持相對穩定，未經歷明顯的種群擴張，或處于臨界狀態。【結論】貴州省茶棍薊馬種群遺傳多樣性較豐富，雖然尚未形成明顯的種群擴張，但可能已處于臨界狀態，應積極采取綜合防控措施，力爭將茶棍薊馬種群數量控制在危害水平以下，以保證貴州省茶產業生產健康可持續發展。

關鍵詞： 茶棍薊馬;mtDNA CO I基因;mtDNA CO II基因;地理種群;遺傳多樣性

中圖分類號： S433.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1684-09

Abstract：【Objective】The study was conducted to investigate genetic diversity among different geographical populations of Dendrothrips minowai Priesner in Guizhou， so as to provide theoretical foundation for the analysis of population genetic dynamics， population dispersion mechanism and formulating control measures. 【Method】The mtDNA CO I and mtDNA CO II sequences of D. minowai populations， which collected from 11 different geographical areas in Guizhou， were selected as molecular markers， population genetic differentiation， gene flow， molecular variance and genetic diversity of populations were analyzed by using software MEGA 6.0， DnaSP 5.10， Arlequin 3.5.2.2， Network 2.0 etc. 【Result】A total of 11 and 9 types of haplotype were detected when the mtDNA CO I and mtDNA CO II gene were analyzed， respectively， haplotype diversity（Hd） of different geographic population were high， which were 0.609 and 0.633， respectively. The total genetic fixations index（FST） were 0.11902 and 0.09052，the total gene flow（Nm） were 2.00 and 2.51， respectively， which indicated that the level of gene communication was high and the genetic differentiation among populations were small. The haplotype network of different geographical populations based on mtDNA CO I and mtDNA CO II showed no obvious branches， and the analysis of molecular variance（AMOVA） of different geographical populations indicated that the genetic variation mainly occurred within the same population. The total neutral test showed that Fus Fs were not significant（P>0.05）， and the mismatch distribution curve had multiple peaks， which indicated the population of D. minowai in Guizhou were relatively stable in recent historical period， and has not experienced evident expansion or at critical state. 【Conclusion】The genetic diversity of D. minowai populations in Guizhou is relatively rich， which has not yet formed an obvious sudden expansion， but might approach to critical phase. Therefore， comprehensive prevention and control measures should be taken actively to control the D. minowai populations quantity under damage level and ensure the sustainable and healthy development of tea production in Guizhou.

Key words： Dendrothrips minowai Priesner; mtDNA CO I gene;? mtDNA CO II gene; geographical population; genetic diversity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31560515）; National Modern Agricultural Industry Technology System Construction Project（CARS-19）; Guizhou Science and Technology Plan Project（NY〔2015〕3011-2）

0 引言

【研究意義】茶棍薊馬（Dendrothrips minowai Priesner）又稱茶棘皮薊馬，屬纓翅目（Thysanoptera）薊馬科（Thripidae）（唐美君和肖強，2018），在我國主要分布于浙江、福建、廣東、廣西、海南和貴州等南方茶區，在山東等也有少量報道（王洪濤等，2018;李貌等，2020）。近年來，茶棍薊馬在貴州省多地為害且逐年加重，個別區域暴發成災，嚴重影響茶葉的產量和品質，成為影響貴州省茶葉生產的主要害蟲之一（彭萍等，2013;呂召云等，2015）。貴州省地貌以山地居多，受多種因素的影響，氣候呈現多樣性，生物多樣性及群體遺傳多樣性也極其豐富，在此基礎上探索茶棍薊馬種群內在的遺傳變異與進化關系等，能從遺傳學角度為有效防控茶棍薊馬提供理論指導。【前人研究進展】目前，針對薊馬遺傳多樣性的研究多集中在入侵性害蟲西花薊馬上。武曉云等（2009）利用PCR克隆并分析了西花薊馬rDNA ITS2和mtDNA CO I基因序列的進化速率，發現rDNA ITS2序列的變異程度比mtDNA CO I高，提出mt-DNA CO I較rDNA ITS2更適合應用于西花薊馬的種內遺傳分析;Brunner和Frey（2010）利用mtDNA CO I基因和微衛星分子標記對美國西部地區西花薊馬種群的遺傳結構進行分析，發現在起源地西花薊馬種群發生了分化，且這種遺傳分化與形態上的分化不一致，推測這種分化是由棲息地的環境不同（地理隔離）造成;喬瑋娜（2012）運用DNA條形碼技術對我國13個省（市）不同地理種群西花薊馬的175條mt-DNA CO I基因序列進行遺傳多樣性和遺傳分化程度分析，推測我國西花薊馬各地理種群的可能來源;Yang等（2012a，2012b）用微衛星和mtDNA CO I分子標記研究西花薊馬在我國的入侵遺傳學，發現傳入我國的西花薊馬在遺傳多樣性上表現出一個明顯的瓶頸效應，揭示西花薊馬可能首先傳入我國云南，隨后云南成為我國其他西花薊馬種群的源頭。沈登榮等（2014）對薊馬科9個屬27種的mtDNA-CO I基因序列變異進行分析，首次報道了茶棍薊馬的mtDNA-CO I基因序列。目前茶棍薊馬雖然已在貴州等多地為害，但其研究僅限于形態（王洪濤等，2018）、空間分布（張莉等，2019）和防治措施（趙志清和陳流光，1998;李慧玲等，2014;涂娟等，2016;董照鋒和張小平，2018;曾明森，2019）等方面，鮮少有利用分子標記技術探討茶棍薊馬遺傳變異方面的相關研究，僅Lü等（2016）利用mtDNA CO I作為分子標記研究了貴州茶棍薊馬的遺傳結構與多樣性，認為貴州省茶棍薊馬種群在近期發生了種群擴張。【本研究切入點】線粒體基因已廣泛運用于動物（尤其是昆蟲）分子進化與系統發育研究（Dickey et al.，2015;Lü et al.，2016）。線粒體基因中的3個細胞色素氧化酶亞基編碼基因（CO I、CO II和CO III）進化速率不同，CO II基因核苷酸序列及其推導氨基酸序列的進化速率均比其他2個亞基（CO I和CO III）高（Peterson et al.，2001）。本研究在Lü等（2016）的研究成果基礎上，選用mtDNA CO I和mtDNA CO II基因作為分子標記，同時增加每個地理種群的測序樣本數，分析貴州省茶棍薊馬不同地理種群的遺傳變異與進化關系。【擬解決的關鍵問題】對貴州省11個地理種群茶棍薊馬群體mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的部分序列進行測序，研究貴州省茶棍薊馬群體的遺傳多樣性及遺傳分化情況，探討群體內在的遺傳變異與進化關系，為掌握貴州省茶棍薊馬的遺傳動態和擴散規律及制定防控措施提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以貴州省不同地理種群的茶棍薊馬為供試樣本。在野外用小毛筆直接蘸取茶樹上的茶棍薊馬，將其放入盛有無水乙醇的樣本管中，記錄樣本采集時間、采集地點及其經緯度等信息，樣本帶回實驗室在顯微鏡下進行鑒定后置于-20 ℃保存。具體采樣信息見表1。

1. 2 基因組DNA提取

茶棍薊馬總DNA的提取參照張利娟等（2011）的鹽析法，提取單頭薊馬DNA，提取的DNA以20 μL無菌超純水充分溶解后-20 ℃保存備用。

1. 3 PCR擴增與序列測定

mtDNA CO I基因序列擴增使用DNA條形碼標準引物LCO1490/HCO2198（Folmer et al.，1994）;參照NCBI數據庫中茶棍薊馬線粒體基因組DNA全長序列中的mtDNA CO II區域，設計mtDNA CO II基因引物DmCO II_F/DmCOI I_R（表2）。反應體系50.0 μL：TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×PrimerSTAR Buffer 10.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板3.0 μL，無菌雙蒸水28.5 μL。mtDNA CO I擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，進行32個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。mtDNA CO II擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行32個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取2.0 μL PCR產物進行電泳檢測后，對確定含有目的片段的產物進行雙向測序（引物合成和測序由北京擎科新業生物技術有限公司完成）。

1. 4 序列分析

利用Chromas 2.23對測序所得序列進行峰圖質量驗證，對序列進行人工讀取和反復校驗后，將正、反向序列進行拼接得到的完整序列片段在NCBI數據庫中進行同源比對，以確定序列是否為所需的目的片段。

1. 5 遺傳學參數計算與分析

利用MEGA 6.0分析序列的堿基組成與多態性位點、轉換/顛換偏倚率等（Tamura et al.，2013）;通過DnaSP 5.10計算核苷酸多樣度（π）、單倍型多樣度（Hd）、核苷酸平均差異數（K）及種群間遺傳固定指數（FST）、基因流（Nm）等遺傳學參數（Librado and Rozas，2009）。利用SAMOVA 2.0（Dupanloup et al.，2002）對不同地理種群間的分子空間變異進行分析，然后根據SAMOVA分組結果，應用Arlequin 3.5.2.2進行中性檢驗、分子遺傳變異方差（AMOVA）和錯配分布分析（Excoffier and Lischer，2010）。使用Network 5.0繪制基于Median-joining的單倍型中介網絡圖（Bandelt et al.，1999）。

2 結果與分析

2. 1 茶棍薊馬mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列特征分析結果

11個茶棍薊馬種群的mtDNA CO I基因經雙向拼接和ClustalW序列比對分析后得到137條序列，片段長度665 bp，共檢測到17個多態性位點，包括11個自裔位點和6個簡約信息位點;所有序列的總突變數為17，其中發生轉換的位點數為15，發生顛換的位點數為5，轉換/顛換率為18.741;所有序列核苷酸A、T、C和G的平均含量分別為31.73%、37.95%、16.64%和13.68%，A+T含量為69.68%，序列堿基組成有明顯的A/T偏好性。mtDNA CO II基因經雙向拼接和比對分析后得到132條序列，片段長度525 bp，共檢測到16個多態性位點，包括9個自裔位點和7個簡約信息位點;所有序列的總突變數為16，其中發生轉換的位點數為13，發生顛換的位點數為3，轉換/顛換率為5.797;所有序列核苷酸A、T、C和G的平均含量分別為35.24%、37.27%、14.55%和12.95%，A+T含量為72.51%，序列堿基組成有明顯的A/T偏好性。

2. 2 茶棍薊馬單倍型及遺傳多樣性分析結果

以mtDNA CO I為靶標基因時，在測序成功的137條序列中共觀測到11種單倍型（Hap1～Hap11），其中，Hap2為共享單倍型，在11個茶棍薊馬種群中均有分布，Hap1為優勢單倍型，在除SN外的10個種群中均有分布;Hap1和Hap2序列共計121條，占序列總數的88.32%;種群單倍型數的范圍為2～5，CS2種群的單倍型數最多（表3）。以mtDNA CO II為靶標基因時，在測序成功的132條序列中共觀測到9種單倍型（Hap1～Hap9），其中，Hap3為共享單倍型，在11個茶棍薊馬種群中均有分布，Hap2在除PX外的10個種群中均有分布;Hap2和Hap3序列共計111條，占序列總數的84.09%;種群單倍型數的范圍為2～4（表4）。

基于mtDNA CO I基因進行分析，結果（表5）顯示，貴州省11個茶棍薊馬地理種群總體Hd為0.609，Hd范圍0.167～0.733，其中GY種群的Hd最大，CS1種群的Hd最小;總體π為0.00129，π范圍為0.00025～0.00213;總體K為0.859，K范圍為0.167～1.418;π和K均以CS2種群最大、CS1種群最小。基于mtDNA CO II基因進行分析，結果（表6）顯示，貴州省11個茶棍薊馬地理種群總體Hd為0.633，Hd范圍為0.248～0.778;總體π為0.00188，π范圍為0.00047～0.00347;總體K為0.985，K范圍為0.248～1.820;GY種群的Hd、π和K均最大，而PX種群的最小。

2. 3 遺傳分化與分子變異分析結果

將11個茶棍薊馬種群作為一個整體進行分析，以mtDNA CO I基因為靶標時，總群體的FST為0.11902，變異范圍為-0.08556～0.52427;總群體的Nm為2.00，變異范圍為-36.02～58.57（表7）。以mtDNA CO II基因為靶標時，總群體的FST為0.09052，變異范圍為-0.08211～0.54221;總群體的Nm為2.51，變異范圍為-215.77～182.23（表8）。綜合分析表明，貴州省不同地理區域的茶棍薊馬種群間基因交流水平較高，種群間遺傳分化較小。但mtDNA CO I基因和mtDNA CO II基因反映各地理種群間的遺傳分化水平并不完全一致。如以mtDNA CO I為靶標基因的分析結果顯示，SN種群與DS和SQ種群間可能存在中度分化;而以mtDNA CO II為靶標基因顯示，彼此間無明顯遺傳分化。

在SAMOVA 2.0中對不同地理種群茶棍薊馬間的分子空間變異進行分析，將各種群的地理信息與遺傳信息結合，得到可能的種群組合方式，結果顯示mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的分組結果一致，均以K=2時的分組結果最佳，即將11個地理種群分成兩組，PX、XY、CS1和CS2為第1組，LS、DZ、DS、SQ、SN、MT和GY為第2組。mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的AMOVA分析結果顯示（表9），同一種群內的遺傳變異分別占總體變異的79.72%和81.63%，各種群內的FST均呈顯著性差異（P<0.01），2個基因的分析均表明種群遺傳變異主要來自種群內部。此外，2個基因分析均表明，不同組間的遺傳變異（FCT）均表現出顯著性差異（P<0.01），組內種群間的遺傳分化顯著，而組內種群間的遺傳變異（FSC）均表現為差異不顯著（P>0.05，下同），組內種群間的遺傳變異不明顯。

2. 4 單倍型系統發育分析結果

基于Median-joining構建的單倍型中介網絡樹分析結果（圖1）顯示，mtDNA CO I基因與mtDNA CO II基因的單倍型中介網絡圖結果基本一致，貴州省11個茶棍薊馬地理種群均未表現出明顯分支。mtDNA CO I基因序列定義了11種單倍型（3個共享單倍型和8個獨享單倍型），其中，Hap1為其他單倍型的核心，出現頻率較高的是Hap1和Hap2，為優勢單倍型，基本分布在每個地理種群中，其他獨享單倍型通過一步或幾步突變與優勢單倍型相連。mtDNA CO II基因序列定義了9種單倍型（4個獨享單倍型和5個共享單倍型），其中，Hap3為其他單倍型的核心，Hap2和Hap3出現頻率較高，為優勢單倍型，基本分布在每個地理種群中，其他獨享單倍型通過一步或幾步突變與Hap2和Hap3相連。

2. 5 種群動態分析結果

從mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的Taijimas D和Fus Fs中性進化模型檢驗結果（表5和表6）可知，11個種群作為一個整體進行分析時，mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的Taijimas D檢驗結果達顯著性負值（P<0.05），而Fus Fs檢驗結果為非顯著性負值，二者結果相反，同時，各種群的Taijimas D和Fus Fs檢驗結果均不顯著地偏離零。11個茶棍薊馬種群總體的錯配分布曲線呈現多峰（圖2），表明種群較穩定，種群近期歷史上未經歷明顯的擴張，與Fus Fs檢驗一致。

3 討論

本研究獲得貴州省11個茶棍薊馬地理種群的137條mtDNA CO I基因序列和132條mtDNA CO II基因序列，2個基因的堿基組成均有明顯的A/T偏好性，具有典型的昆蟲mtDNA基因堿基組成特點（Jermiin and Crozier，1994;Simon et al.，1994）。另外，Simon等（1994）認為，親緣關系較近的分類單元核苷酸堿基轉換大于顛換，而親緣關系遠的分類單元則相反。本研究中，mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列的轉換/顛換偏倚率R分別為18.741和5.797，與Simon等（1994）的觀點一致。Knight和Mindell（1993）認為，轉換/顛換偏倚率R的臨界值為2，當R<2時，可認為基因突變達飽和狀態;反之，當R>2時表示基因突變尚未達飽和狀態。本研究中，貴州省11個茶棍薊馬地理種群所有mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列的轉換/顛換偏倚率R均大于2，表明貴州省茶棍薊馬mtDNA CO I和mtDNA CO II基因序列的堿基突變尚未達飽和狀態。

Hd和π主要用于衡量一個種群線粒體基因的遺傳多樣性（張桂芬等，2014）。本研究對貴州省11個茶棍薊馬地理種群基于mtDNA CO I和mtDNA CO II基因的研究結果顯示，mtDNA CO I基因序列定義11種單倍型（3個共享單倍型和8個獨享單倍型）;mtDNA CO II基因序列定義9種單倍型（4個獨享單倍型和5個共享單倍型），說明貴州省各地理種群茶棍薊馬的mtDNA既存在一定的交流，又有一定程度的遺傳分化。基于mtDNA CO I基因和mtDNA CO II基因進一步對總群體的FST和Nm進行綜合分析顯示，總群體的FST均在0.05～0.15范圍內，Nm均大于1，說明貴州省不同地理區域的茶棍薊馬種群間基因交流水平較高，種群間遺傳分化較小（Balloux and Lugon-Moulin，2002）。另一方面，mtDNA CO I基因和mtDNACO II基因反映各地理種群間的遺傳分化水平并不完全一致，Hua等（2008）研究認為不同線粒體基因和蛋白編碼基因不同位點的進化速率不同，因此，可推測mtDNA CO I基因和mtDNACO II基因反映各地理種群間的遺傳分化水平不一致是由基因突變的速率存在差異所造成。

Taijimas D（Tajima，1989）和Fus Fs（Fu，1997）檢驗是目前應用最廣泛的兩種中性檢驗模型，可用這2種模型來推算種群的歷史動態變化（Nielsen，2005）。當中性檢驗結果為顯著負值時，表明種群在歷史上曾發生過規模擴張和定向選擇;當中性檢驗結果為顯著正值時，表明種群在歷史上曾發生過萎縮和平衡選擇;當中性檢驗結果不顯著地偏離零時，中性零假說也不能被排除，表明種群在歷史上保持相對穩定（Tajima，1989;Fu，1997）。從mtDNA CO I和mtDNACO II基因的中性進化模型檢驗結果可看出，各種群的Taijimas D和Fus Fs檢驗結果均未達顯著差異水平;但將11個茶棍薊馬種群作為一個整體進行分析時，2個基因的Taijimas D檢驗結果達顯著水平（P<0.05），而Fus Fs檢驗結果未達顯著水平，結果正好相反。有研究表明，Fus Fs比Taijimas D能更好地檢驗種群的擴張現象（Ramosonsins and Rozas，2002）。進一步進行錯配分布分析發現，貴州省11個茶棍薊馬種群總的錯配分布曲線為多峰;Harpending等（1998）認為最近形成的或發生了擴張現象的種群，其錯配分布曲線呈單峰，相反，存在時間較長或相對穩定的種群，其錯配分布曲線呈多峰。本研究中，2個分子標記的錯配分布曲線為多峰，與Fus Fs檢驗結果一致，表明種群較穩定，近期歷史尚未形成明顯擴張。Lü等（2016）研究表明貴州省茶棍薊馬經歷了明顯的擴張，與本研究結果存在一定的分歧，究其原因：一方面可能是分析樣本數引起的偏差;另一方面，從2個基因的錯配分布曲線上看，除第一個峰外，后面的峰形很低，可能存在一種擴張與未擴張之間的臨界狀態。

本研究樣本采集地僅限于貴州省部分地區，在遺傳分化與多樣性的分析上可能存在一定偏差。另外，關于茶棍薊馬目前在多省（區）茶區為害的情況，應對全國各省（區）為進行深入調查，如有必要可對全國范圍內的茶棍薊馬遺傳多樣性進行系統研究，及時掌握種群動態，以防止該蟲在全國各大茶區擴張和暴發。

4 結論

貴州省茶棍薊馬總體遺傳多樣性較高，種群間發生了一定分化，雖然尚未形成明顯的種群擴張，但可能已處于擴張與未擴張之間的臨界狀態。因此，在農業生產中應重視對茶棍薊馬的防控工作，積極采取綜合防控措施，力爭將茶棍薊馬種群數量控制在危害水平以下，以保證貴州省茶產業生產健康可持續發展。

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（責任編輯 麻小燕）